23株海洋真菌的分子鉴定及其抗植物病原真菌和细胞毒活性研究

杨小岚陈玉婵李浩华章卫民

（1.中国科学院南海海洋研究所，广州 510301；2.广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070；3.中国科学院大学，北京 100049）

23株海洋真菌的分子鉴定及其抗植物病原真菌和细胞毒活性研究

杨小岚1，2，3陈玉婵2李浩华2章卫民2

（1.中国科学院南海海洋研究所，广州 510301；2.广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070；3.中国科学院大学，北京 100049）

从南海沉积物中分离得到23株海洋真菌，通过ITS测序进行鉴定。以新月弯孢霉（Curvularia lunata）、柱枝双胞霉（Cylindrocladium scoparium）、链格孢（Alternaria alternata）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）为受试植物病原真菌，以神经胶质瘤细胞（SF-268）、乳腺癌细胞（MCF-7）、大细胞肺癌细胞（NCI-H460）和肝癌细胞（HepG-2）为受试肿瘤细胞，分别采用生长速率法和SRB法对这些菌株的发酵液粗提物进行抗植物病原真菌和细胞毒活性测试，发现11个菌株的粗提物在浓度为50 mg/mL时，对至少1种受试植物病原真菌的抑制率在50%以上，有9个菌株的粗提物在浓度为100 μg/mL时，对至少1种肿瘤细胞株的抑制率在80%以上，其中菌株Eupenicilliumsp. FS100、Penicilliumsp. FS105、Dichotomomyces cejpiiFS110、Acaromyces ingoldiiFS121对植物病原真菌和（或）肿瘤细胞具有明显的抑制活性。

海洋真菌 分子鉴定 提取物 抗植物病原真菌 细胞毒活性

生命起源于海洋，海洋生物种类繁多，按生物学统计高达30多门50余万种，生物总量占地球生物总量的87%，然而海洋生物的资源利用率不到1%［1］。海洋生物的生活环境与陆生生物相比有较大不同，高盐、高压、寡营养、低温且相对恒温以及有限的光照和缺氧等特殊的生长环境，使得海洋生物次生代谢的途径和酶反应机制与陆地生物几乎完全不同［2］，海洋微生物尤其是海洋真菌，以其代谢产物结构新颖、生物活性高等特点成为拓展天然药用资源的新空间，也是目前资源最丰富、保存最完整的、最具有新药开发潜力的领域［3-5］。到目前为止，已从海洋真菌的发酵产物中发现了1 117个新的次生代谢产物，这些代谢产物表现出良好的抗肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性［3，6，7］。

作者对分离自中国南海海洋沉积物样品的23株真菌进行分子鉴定，通过其发酵液粗提物的活性测试，从中筛选具有抗植物病原真菌或细胞毒活性的菌株，旨在发掘具有潜在应用前景的高活性菌株，为开发新的微生物药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 海洋真菌、供试植物病原真菌和细胞株 23株海洋真菌于2011年9月从南海沉积物样品中分离得到。供试植物病原真菌为新月弯孢霉（Curvularia lunata）购于中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）、柱枝双胞霉（Cylindrocladium scoparium）、链格孢（Alternaria alternata）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）由华南农业大学姜子德教授提供。

供试肿瘤细胞株为神经胶质瘤细胞（SF-268）、乳腺癌细胞（MCF-7）、大细胞肺癌细胞（NCI-H460）、肝癌细胞（HepG-2），由江苏省药用植物生物技术重点实验室蒋继宏教授提供。以上所有菌株和细胞株均保藏于广东省微生物研究所。

1.1.2 培养基 植物病原真菌菌株的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，维生素B110 mg，琼脂18 g，加水至1 L；海洋真菌的培养基为含有1.5%粗海盐的PDA培养基，液体发酵培养基为含有1.5%粗海盐的马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）。

肿瘤细胞培养基为含有10%胎牛血清和1%双抗（10 000 U/mL青霉素和链霉素）的RPMI-1640基础培养基。

1.1.3 试剂Taq酶及其他的 PCR 相关试剂购于大连宝生物工程有限公司，其他分析纯化学试剂均为市售。

1.2 方法

1.2.1 海洋真菌菌株的分离纯化 无菌条件下称取沉积物样品约1 g，加入无菌海水 9 mL，振荡混匀，再分别稀释 10倍和100倍，共制成 3 个浓度梯度的样品，各取 0. 2 mL 涂布于含1.5%粗海盐的PDA固体培养基，每个梯度涂布多个平板，28℃培养，每天观察并挑出单个生成菌落，纯化后接种于PDA斜面培养基。

1.2.2 海洋真菌的分子鉴定 基因组DNA的提取方法参照SDS-CTAB法［8］。PCR扩增采用真菌ITS rDNA的通用引物ITS1（5'-TCCGATGGTGAACCTGCG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）［9］扩增分离菌株的ITS rDNA区。PCR采用20 μL反应体系，通过ExTaq（TaKaRa）进行，反应条件为93℃预变性3 min；93℃变性45 s，55℃复性45 s，72℃延伸1.5 min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。反应产物利用PCR产物纯化试剂盒（QIAGEN）纯化，纯化后的样品由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，测序获得的序列通过BLAST程序在GenBank上进行相似性序列检索分析，初步确定海洋真菌的种类。

1.2.3 菌株粗提物浸膏的制备 将低温保藏的斜面菌种分别接种到PDA平板上，28℃活化3 d，挑取各菌株接种到含有1.5%粗海盐的PDB液体培养基中，28℃、120 r/min条件下摇床培养7 d，用四层纱布过滤收集发酵液。用乙酸乙酯等体积萃取发酵液4次，合并萃取液于40℃减压浓缩，得到各菌株粗提物浸膏。

1.2.4 细胞毒活性测定 采用SRB法［10］测定发酵液提取物对肿瘤细胞NCI-H460、SF-268、MCF-7和HepG-2的生长抑制率，各粗提物的浓度为100 μg/mL，以顺铂作为阳性对照，浓度为20 μg/mL，每处理重复3次。

1.2.5 抗植物病原真菌活性筛选 采用生长速率法［11］测定发酵液提取物抗植物病原真菌活性：将各粗提物浸膏分别溶于DMSO，浓度为50 mg/mL。取样品提取液0.1 mL均匀涂布到PDA平板上，从活化后的植物病原真菌菌落边缘，取直径为4 mm的菌饼置于培养皿中央，每处理重复3次，以DMSO代替样品作为空白对照。28℃恒温培养72 h，采用十字交叉法记录菌饼生长直径，计算抑制率。

其中，纯生长量（mm）=菌饼生长直径（mm）-4 1.2.6 最低抑菌浓度的测定 根据抗植物病原真菌活性筛选结果，选取高活性菌株进一步测定其最低抑制浓度（MIC），测定方法参照美国临床实验室标准委员会（NCCLS）的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药敏试验参考方案》进行。向无菌96孔板的A-G孔分别加入100 μL用PDB培养基倍比稀释的待测样品，使各孔的最终样品浓度为12.5、6.25、 3.125、1.5625、0.7812、0.3906和0.1953 mg/mL，再向每孔中分别加入106-107CFU/mL病原真菌菌悬液100 μL，以DMSO代替样品作为空白对照。每处理重复3次，28℃培养72 h后根据菌株的生长状况判断最小抑菌浓度。

2 结果

2.1 海洋真菌的分子鉴定

自中国南海沉积物样品中共分离得到23株不同的海洋真菌，将测序后获得的ITS序列提交到GenBank数据库，并进行BLAST分析，结果分别鉴定为7株青霉属（Penicillium）真菌、6株曲霉属（Aspergillus）真菌、3株枝孢菌属（Cladosporium）真菌、2株正青霉属（Eupenicillium）真菌以及热带茎点霉（Phoma tropica）、外瓶霉（Exophialasp.）、埃德菌（Dichotomomyces cejpii）、棘壳孢菌（Pyrenochaetasp.）和类酵母真菌（Acaromyces ingoldii）各1株（表1）。

2.2 细胞毒活性测定

各菌株发酵液提取物的细胞毒活性测试结果见表2。从表2可以看出，有3株海洋真菌对神经胶质瘤细胞SF-268的抑制率在80%以上；有8株对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率在80%以上；有4株对肺癌细胞NCI-H460的抑制率在80%以上；有3株对肝癌细胞HepG-2的抑制率在80%以上，其中菌株Dichotomomyces cejpiiFS110和Acaromyces ingoldiiFS121对所有受试肿瘤细胞株的抑制率均在90%以上，Eupenicilliumsp. FS100对所有受试肿瘤细胞株的抑制率在80%以上。

2.3 抗植物病原真菌活性测定

抑菌试验结果（表3）显示有11株真菌的发酵液提取物对至少1种受试植物病原真菌的抑制率在50%以上，其中有3个菌株的抑菌效果显著，菌株Dichotomomyces cejpiiFS110的抑菌效果尤为突出，对胶孢炭疽菌、链格孢、新月弯孢霉和柱枝双胞霉的抑制率均在90%以上，Penicilliumsp. FS105对胶孢炭疽菌和新月弯孢霉的抑制率分别为96.90%、90.57%，Eupenicilliumsp. FS100对链格孢的抑制率为94.20%。

2.4 最小抑菌浓度测定

选取抗植物病原真菌活性显著的3个菌株Eupenicilliumsp. FS100、Penicilliumsp. FS105和Dichotomomyces cejpiiFS110，测定其发酵液提取物对上述4种植物病原真菌的最小抑菌浓度，结果（表4）显示FS110发酵液提取物对4种受试植物病原真菌的最小抑菌浓度均为≤0.20 mg/mL，FS100对链格孢的最小抑菌浓度为≤0.20 mg/mL；FS105对胶孢炭疽菌的最小抑菌浓度为≤0.20 mg/mL。

3 讨论

海洋真菌的次生代谢产物是抗癌、抗细菌、抗病毒、抗病原真菌药物的巨大资源宝库［12，13］。对海洋资源的开发利用、海洋活性菌株的筛选以及活性成分的分离纯化成为当今研究的热点［14］。为了从海洋真菌中发掘新型药用天然产物，作者对南海海洋沉积物中分离到的23株海洋真菌进行了分子鉴定，并从中筛选到11株抗植物病原真菌抑制率在50%以上的菌株和9株对肿瘤细胞抑制率在80%以上的菌株，其中菌株Eupenicilliumsp. FS100、Penicilliumsp. FS105、Dichotomomyces cejpiiFS110和Acaromyces ingoldiiFS121具有明显的抗植物病原真菌活性和（或）细胞毒活性。

Dichotomomyces cejpii曾经从日本的海域［15］以及日本、荷兰、丹麦、印度的土壤［16］中分离得到。1999年Pieckovó等［17］发现菌株D. cejpii的提取物具有广谱的抗菌效果，甚至对一些耐药菌也有较好的抑制效果。2007年Ogata等［18］从菌株D. cejpiivar.cejpiiNBRC 103559的菌丝体中分离得到一种新的吲哚双萜（JBIR-03），该化合物能有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和苹果树腐烂病菌（Valsa ceratosperma）。本研究首次从南海深海沉积物中分离获得菌株D. cejpiiFS110，经细胞毒活性测试，发现其发酵液提取物对肿瘤细胞株NCI-H460、SF-268、MCF-7、HepG-2具有显著的抑制活性，对植物病原真菌也有明显的抑制作用。Acaromyces ingoldii为一种稀有的类酵母真菌，是Acaromyces属内唯一的已知种，由Boekhout等［19］于2003年首次从以色列的葡萄柚叶片上的柑橘锈蜱（citrus rust mite）中分离得到。2005年，Yasuda［20］从日本水梨果实的病斑上分离到该菌菌株PFS 007。2009年，魏育慧等［21］从台湾的木天蓼植株表面也分离得到该菌菌株BCRC 08F0505。据报道，该真菌在生物防治的应用上颇具潜力［22］。本研究首次从南海深海环境中分离得到菌株A.ingoldiiFS121，并发现其发酵液提取物具有显著的细胞毒活性，对4种受试肿瘤细胞株的抑制率均在90%以上。此外，菌株Eupenicilliumsp. FS100的发酵液提取物也具有较好的细胞毒活性，对4种受试肿瘤细胞株的抑制率均在85%以上，而菌株Penicilliumsp. FS105的发酵液提取物则对胶孢炭疽菌和新月弯孢霉有明显的抑制活性，抑制率分别达到96.9%和90.6%。因此，本研究筛选获得的4株海洋真菌FS100、FS105、FS110、FS121具有重要的研究价值，值得进一步深入研究。

4 结论

本研究从南海沉积物中分离鉴定了23株海洋真菌，经活性测试结果显示有11株海洋真菌的发酵液提取物对至少1种受试植物病原真菌的抑制率在50%以上，有9株对至少1种受试肿瘤细胞株的抑制率在80%以上，其中菌株Eupenicilliumsp. FS100、Penicilliumsp. FS105、Dichotomomyces cejpiiFS110、Acaromyces ingoldiiFS121对植物病原真菌和（或）肿瘤细胞具有明显的抑制活性。

［1］史清文, 李力更, 霍长虹, 等. 海洋天然产物研究概述［J］. 中草药, 2010, 41（7）：1031-1047.

［2］史清文, 霍长虹, 李力更, 等. 海洋天然产物化学研究的历史回顾［J］. 中草药, 2009, 40（11）：1687-1695.

［3］Bugni TS, Ireland CM. Marine-derived fungi：a chemically and biologically diverse group of microorganisms［J］. Nat Prod Rep, 2004, 21（1）：143-163.

［4］Faulkner DJ. Marine natural products［J］. Nat Prod Rep, 2001, 18（1）：1-49.

［5］ Saleem M, Ali MS, Hussain S, et al. Marine natural products of fungal origin［J］. Nat Prod Rep, 2007, 24（5）：1142-1152.

［6］ Moore BS. Biosynthesis of marine natural products：microorganisms［J］. Nat Prod Rep, 2005, 22（5）：580.

［7］ 朱伟明, 王俊锋. 海洋真菌生物活性物质研究之管见［J］. 菌物学报, 2011, 30（2）：218-228.

［8］Guo LD, Hyde KD, Liew ECY. Detection and taxonomic placement of endophytic fungi within frond tissues of Livistona chinensis based on rDNA sequences［J］. Mol Phylogenet Evol, 2001, 20（1）：1-13.

［9］White TJ, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［M］. PCRProtocols. San Diego：Academic Press, 1990：315-322.

［10］Beara IN, Lesjak MM, Četojević-Simin DD, et al. Phenolic profile, antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activities of endemic Plantago reniformis G. Beck［J］. Food Res Int, 2012, 49（1）：501-507.

［11］Chang HT, Cheng YH, Wu CL, et al. Antifungal activity of essential oil and its constituents from Calocedrus macrolepis var. formosana Florin leaf against plant pathogenic fungi［J］. Bioresour Technol, 2008, 99（14）：6266-6270.

［12］Bhadury P, Mohammad BT, Wright PC. The current status of natural products from marine fungi and their potential as antiinfective agents［J］. J Ind Microbiol Biot, 2006, 33（5）：325-337.

［13］Newman DJ, Hill RT. New drugs from marine microbes：the tide is turning［J］. J Ind Microbiol Biotechnol, 2006, 33（7）：539-544.

［14］Vignesh S, Raja A, James RA. Marine drugs：implication and future studies［J］. Int J Pharmacol, 2011, 7（1）：22-30.

［15］Ueda S. A mycofloral study on brackish water sediments in Nagasaki, Japan［J］. Trans Mycol Soc Japan, 1980, 21：108-112.

［16］Scott DB. Dichotomomyces cejpii（Mil’ko）comb. nov［J］. Trans Br Mycol Soc, 1970, 55（2）：313-316.

［17］Pieckovó E, Roeijmans H. Antibiotic secondary metabolites of Dichotomomyces cejpii［J］. Mycopathologia, 1999, 146（3）：121-126.

［18］Ogata M, Ueda JY, Hoshi M, et al. A novel indole-diterpenoid, JBIR-03 with anti-MRSA activity fromDichotomomyces cejpiivar. cejpii NBRC 103559［J］. J Antibiot, 2007, 60（10）：645-648.

［19］Boekhout T, Theelen B, Houbraken J, et al. Novel anamorphic mite-associated fungi belonging to the Ustilaginomycetes：Meira geulakonigii gen. nov., sp. nov., Meira argovae sp. nov. andAcaromyces ingoldiigen. nov., sp. nov［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53（5）：1655-1664.

［20］Yasuda F, Yamagishi D, Akamatsu H, et al. Fruit stain of Japanese pear caused by basidiomycetous, yeast-like fungi, Acaromyces ingoldii and Meira sp.［J］. Jpn J Phytopathol, 2005, 71（3）：156.

［21］魏育慧, 刘桂郁, 李福临. 以形态、生理及分子特性鉴定Acaromyces ingolgii［C］//2009海峡两岸第九届真菌暨第二届食药用菌学术研讨会论文摘要集, 2009：44-45.

［22］Gerson U, Gafni A, Paz Z, et al. A tale of three acaropathogenic fungi in Israel：Hirsutella,MeiraandAcaromyces［J］. Exp Appl Acarol, 2008, 46（1-4）：183-194.

（责任编辑 李楠）

Molecular Identification of 23 Marine Fungal Strains and Their Activities Against Plant Pathogenic Fungi and Cytotoxic Activities

Yang Xiaolan1，2，3Chen Yuchan2Li Haohua2Zhang Weimin2
（1. South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301；2. State Key Laboratory of Applied Microbiology，South China（the Ministry-Province Joint Development），Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510070；3. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049）

Twenty three marine fungal strains were isolated from the sediments of the South China Sea and identified by intergenic transcribed spacer（ITS）sequencing. The fermentation broth extracts of these marine fungal strains were tested for their inhibitory activities against growth of 4 plant pathogenic fungi, namelyColletotrichum gloeosporioides,Alternaria alternate,Curvularia lunata, Cylindrocladium scoparium, and investigated for their cytotoxic activities against SF-268, MCF-7, NCI-H460 and HepG-2 tumor cell lines by the SRB method. The results showed the extracts of 11 strains presented higher than 50% inhibitory rates against at least one of those plant pathogenic fungi at a concentration of 50 mg/mL and the extracts of 9 strains presented higher than 80% inhibitory rates against at least one of those tumor cell lines at a concentration of 100 μg/mL. Among all strains studied,Eupenicilliumsp. FS100,Penicilliumsp. FS105,Dichotomomyces cejpiiFS110 andAcaromyces ingoldiiFS121 exhibited obvious inhibitory activities against plant pathogenic fungi and/or tumor cell lines.

Marine fungi Molecular identification Extract Activity against plant pathogenic fungi Cytotoxicity

2013-12-18

国家自然科学基金项目（31272087），国家“863”计划资助项目（2012AA092104），广东省自然科学基金项目（S2013010014557），广州市科技计划项目（2013J4100067）

杨小岚，女，硕士研究生，研究方向：海洋微生物活性代谢产物；E-mail：1617694366@qq.com

章卫民，男，博士，研究员，研究方向：药用微生物资源及其活性物质；E-mail：wmzhang58@qq.com