利用细菌表达dsRNA介导黄粉虫抗冻蛋白基因的RNA干扰

石萌 刘小宁 马纪

（新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046）

利用细菌表达dsRNA介导黄粉虫抗冻蛋白基因的RNA干扰

石萌 刘小宁 马纪

（新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046）

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是研究基因功能的一种重要工具。为了利用RNAi技术对黄粉虫抗冻蛋白（Antifreeze protein，AFP）基因的非抗冻功能进行验证，将黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433的相应干扰片段构建至L4440干扰载体并转化大肠杆菌HT115（DE3）菌株，利用IPTG诱导表达特异的afp基因相应dsRNA，纯化后注射黄粉虫幼虫，通过实时荧光定量PCR检测afp基因在mRNA水平的变化。结果显示含有L4440-Tmafp重组质粒的HT115菌株可以表达干扰afp基因的dsRNA，命名为Tmafp-dsRNA。用Tmafp-dsRNA注射黄粉虫24 h后，Tmafps的表达受到显著抑制，相比对照下降了60.8%。本研究表明通过注射dsRNA可有效抑制黄粉虫afp基因的表达。

黄粉虫 抗冻蛋白基因 RNA干扰 双链RNA L4440载体

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指内源或外源双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱导的靶基因转录后沉默的现象，在1998年由Fire等人首次证实［1］。随后RNAi被广泛用于基因功能、基因治疗研究等多个领域。在昆虫中，RNAi首先被用于研究模式昆虫果蝇［2］，随后在鳞翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目等多种昆虫中得到广泛应用［3］。RNAi可作为一种有力的工具来研究昆虫基因功能或进行害虫控制。

进行RNAi的方式可分为细胞内RNAi和细胞外RNAi［4］。细胞内RNAi多通过浸染、电穿孔或显微注射的方式将dsRNA直接导入细胞；而细胞外RNAi则通过浸泡、饲喂或注射进行dsRNA的递送，需要依靠细胞摄取dsRNA。利用RNAi技术研究昆虫基因功能多以饲喂混有dsRNA的人工饲料［5］或注射dsRNA［6］的方式进行。饲喂方法简便，成本低，但由于多数昆虫对饲喂的dsRNA不敏感，不能诱发RNAi效应，如东亚飞蝗（Locusta migratoria）［7］等。注射法直接将dsRNA注入昆虫的血腔中，进而诱发RNAi，因此普遍用于昆虫基因功能的研究［3，8］。对鞘翅目昆虫多采用幼虫注射法导入体外转录合成的dsRNA。通过将目的基因的干扰片段构建至L4440 dsRNA表达载体后转化RNase-III缺陷型的大肠杆菌HT115（DE3）菌株，可诱导表达相应的dsRNA。王根洪等［9］通过提取细菌表达的dsRNA注射家蚕（Bombyx mori），成功实现了对FTZ-F1基因的RNA干扰。

抗冻蛋白（Antifreeze protein，AFP）是一类能抑制冰晶生长的特殊蛋白质。它可降低溶液的冰点，而不改变熔点，导致熔点和冰点之间出现差值，即热滞活性［10］，从而增强昆虫的耐寒性。抗冻蛋白具有抑制重结晶、维持体液过冷却等多种功能。然而，我们的前期研究发现，鞘翅目拟步甲科的小胸鳖甲抗冻蛋白具有热保护作用［11］，高温和干旱都能诱导该基因的表达。因此，抗冻蛋白除了具有抑制冰晶生长的功能外，可能还具有其他非抗冻的保护功能，为了全面研究抗冻蛋白的功能，本研究以同为拟步甲科的黄粉虫（Tenebrio molitor）为研究对象，利用其饲养成熟、来源丰富、抗冻蛋白热滞活性高的特点，构建基因干扰载体，转化大肠杆菌，诱导表达dsRNA，然后注射黄粉虫，结果显示所设计的dsRNA能够干扰黄粉虫afp基因的表达，为进一步验证afp基因的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试虫来源 黄粉虫购自乌鲁木齐市南园花卉市场，饲养于恒温光照培养箱内。饲养温度（25± 0.5）℃，相对湿度（30±6）%，光周期16L∶8D。以麦麸为主要饲料，2 d喂食一次卷心菜叶补充水分。

1.1.2 主要试剂 SYBR Green Supermix kit、TRizol试剂购自Invitrogen公司，Taq酶、DNase I、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、Oligo（dT）、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、DNA Marker、 pMD18-T、T4连接酶、限制性内切酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa），SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒及DEPC购自上海生工生物工程股份有限公司，感受态细胞菌种DH5α购自北京全式金生物技术有限公司，L4440载体和大肠杆菌HT115菌株为本实验室保藏，其余试剂为国产分析纯。引 物 合 成 和 测 序 由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 黄粉虫抗冻蛋白基因干扰载体的构建 根据黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433（GenBank号AF160497）序列，利用Primer5.0软件设计扩增afp基因的RNA干扰片段（408 bp）的引物，上下游引物分别带有BglII和PstI酶切位点。序列分别为afp F1：AGATCTTGGTTAATTATAGCAGTTATCGTTATG TG；afp R1：CTGCAGTCCGGGACATCCTGTT（下划线表示添加的酶切位点）。以前期构建的pMD18-TTmafp433质粒为模板，进行PCR扩增，反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 40 s，35个循环；72℃ 10 min；产物在4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR扩增产物（记为Tmafp片段），连接pMD18-T载体，连接产物转化DH5α感受态细胞后，涂布含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板，37℃培养12 h后，挑取阳性克隆于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，然后进行菌液PCR鉴定；并提取重组质粒用BglII和PstI进行酶切鉴定，将鉴定正确的pMD18T-Tmafp重组子送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序验证。将鉴定正确的pMD18T-Tmafp重组质粒与L4440干扰载体分别同时用BglII和PstI进行双酶切，回收目的片段，用T4连接酶于16℃连接，获得L4440-Tmafp重组质粒，然后转化DH5α感受态细胞。挑取阳性单克隆于LB含有氨苄青霉素的液体培养基中培养，并进行菌液PCR及质粒双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒进一步测序验证。将L4440-Tmafp重组质粒转至采用CaCl2法制备的HT115感受态细胞中，在氨苄青霉素和四环素抗性的LB固体培养基上筛选阳性克隆，并通过PCR及双酶切进行鉴定。构建过程如图1所示。

1.2.2 黄粉虫抗冻蛋白基因dsRNA的诱导表达及纯化 试验以果蝇白眼基因的dsRNA（片段大小为421 bp）作为无关dsRNA对照（记为W-dsRNA），其干扰载体为实验室前期构建，经PCR及酶切鉴定后，活化菌种直接诱导表达。参照胡有燕［12］、王根洪等［9］的方法原核表达W-dsRNA和Tmafp-dsRNA，并对表达条件进行优化。将携带L4440-Tmafp及L4440-W质粒的HT115菌液接种于氨苄青霉素和四环素抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养12 h后，按1%接种于液体培养基中，37℃振荡培养菌液至OD600=0.4左右，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达。37℃振荡培养4 h后，于4℃，4 000 r/min离心3 min，收集菌体，采用TRIzol法提取细菌总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测细菌总RNA。然后分别利用DNaseI和RNaseA消化细菌总RNA各30 min［13］，再用三氯甲烷抽提，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤后晾干，溶于DEPC处理水中，并利用NanoDrop ND-1000分光光度计（NanoDrop Technologies，Wilmington，USA）检测dsRNA浓度。-80℃保存备用。

1.2.3 黄粉虫抗冻蛋白基因的RNA干扰 选取生长一致的末龄黄粉虫随机分为4组，用10 μL微量进样器注射dsRNA，每组60头幼虫。第1组为试验组，每头幼虫注射5 μg（1 μg/μL）TmafpdsRNA；第2组为无关dsRNA对照组，每头幼虫注射5 μg（1 μg/μL）W-dsRNA；第3组为空白对照组，每头幼虫注射5 μL PBS缓冲液；第4组不作任何处理。RNAi后于正常条件下继续饲养，统计各组黄粉虫幼虫的死亡率。注射24 h后TRIzol法提取各组黄粉虫的总RNA，并反转为cDNA，通过实时荧光定量PCR检测黄粉虫afp基因的表达。每组设置3个平行，每个平行取2只幼虫提取RNA。黄粉虫afp基因实时荧光定量PCR引物为：afpF2：AGCAGTTATCGTTATGTGTTTGTGT；afpR2：GGTACACGTTATTGCATTTGGAC；以黄粉虫18S基因作为内参基因，实时荧光定量PCR引物为：18S F：TCAGATACCGCCCTAGTTCTAACCA；18S R：TCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGC。实时荧光定量PCR反应按带有ROX的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG的使用说明进行。取等量cDNA进行PCR反应，每个样品重复3次。于GeneAmp Thermal Cycler 7500中进行实时荧光定量PCR反应，程序为：50℃ 2 min；95℃ 3 min；95℃ 10 s，58℃30 s，72℃ 30 s，40个循环。

1.2.4 数据分析 基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCT法。afp基因表达量是与内参基因相比的相对表达量，并以未处理的对照组进行归一化处理。采用医学生物统计学软件GraphPad Prism 4.0中的单因素方差分析和Turkey多重比较分析数据。

2 结果

2.1 黄粉虫抗冻蛋白基因干扰载体的构建

2.1.1 含有BglII和PstI酶切位点的Tmafp433基因干扰片段的克隆 黄粉虫抗冻蛋白基因存在众多亚型，编码小分子蛋白质，基因序列较短。考虑到长片段dsRNA比短片段dsRNA更容易诱发RNAi［14，15］，因此选择序列相对较长的Tmafp433基因。Tmafp433基因的ORF序列长度为447 bp，编码148个氨基酸，含有7个拟步甲科昆虫抗冻蛋白特有的“TCTXSXXCXXAX”重复序列。通过在线预测（http：//bioinfo. clontech.com/rnaidesigner/sirnaSequenceDesign.do） 潜在的RNAi靶序列发现在其33-423 bp的位置存在22个可能的干扰靶位点，所以选择了包含这些潜在靶位点的408 bp序列作为干扰片段。

以前期构建的pMD18T-Tmafp433质粒为模板，用afp F1/F2引物PCR扩增预期大小为420 bp的片段。电泳结果（图2-A）显示，扩增片段位于接近500 bp的位置，与预期大小一致。将目的片段回收连接至pMD18-T载体上，对重组子进行酶切鉴定（图2-B）并测序，证实序列正确。

2.1.2Tmafp433基因干扰载体的构建及鉴定 将pMD18T-Tmafp重组质粒与L4440载体质粒双酶切（BglII/PstI），回收后连接（图3-A）。重组子经菌液PCR检测，得到一条大小接近500 bp的条带（图3-B），与预期相符。重组质粒经双酶切后得到一条约2 700 bp和一条约500 bp的条带（图3-C），与目的片段及线性L4440质粒片段大小一致，表明Tmafp433基因干扰片段已构建至L4440载体上。对重组质粒进行测序验证，证实构建正确。

2.2 Tmafp-dsRNA 和W-dsRNA的诱导表达

分别对含有L4440-Tmafp和L4440-W重组质粒的HT115菌株进行诱导表达，在OD600为0.4时加入IPTG（终浓度为0.5 mmol/L）诱导，37℃培养4 h。提取诱导前及诱导后的菌体总RNA，结果显示，携带 L4440-Tmafp（图4-A）和L4440-W（图4-B）质粒的HT115在诱导后均在分子量接近500 bp的位置多出现一个与预期dsRNA片段大小一致的条带，如箭头所示。用DNase I和RNase A对诱导后的总RNA进行消化，电泳检测显示菌体DNA及RNA被降解，仅在诱导后出现多余条带的位置残余一个条带，据此判定携带L4440-Tmafp和L4440-W的HT115菌液诱导后出现的特异条带分别为TmafpdsRNA及W-dsRNA，表明可通过细菌诱导表达Tmafp-dsRNA及W-dsRNA。

2.3 抗冻蛋白基因干扰后黄粉虫幼虫的死亡率统计

对黄粉虫幼虫注射PBS、W-dsRNA和TmafpdsRNA后均出现不同程度的死亡（图5）。其中注射PBS和W-dsRNA后黄粉虫在24 h时即出现少量死亡，之后死亡率不再增加，与未注射对照组没有显著差异，推测黄粉虫的死亡是由注射造成。而注射Tmafp-dsRNA后黄粉虫的死亡率呈上升趋势，在48 h达到最高，为9.12%，和其他处理组均有显著差异（P＜0.05）。

2.4 实时荧光定量PCR检测黄粉虫抗冻蛋白基因干扰后的表达

为了检测注射Tmafp-dsRNA是否会抑制黄粉虫抗冻蛋白基因的表达，对注射24 h后的dsRNA处理组和对照组的黄粉虫cDNA样品进行实时荧光定量PCR检测。结果（图6）显示，注射Tmafp-dsRNA组的TmafpmRNA水平的相对表达量显著低于3个对照组，即未注射组（control）、注射PBS组和注射W-dsRNA组。其中注射Tmafp-dsRNA后黄粉虫的afp相对表达量相比未注射组下降了60.8%，表明细菌表达的Tmafp-dsRNA可显著抑制黄粉虫afp基因的表达。而注射PBS和W-dsRNA试验组的afp表达量显著高于未注射组，分别上升了43.7%和39.1%，推测可能是注射对黄粉虫产生了刺激，从而引起afp基因的上调表达。

3 讨论

本研究构建了干扰黄粉虫抗冻蛋白基因afp的dsRNA，在大肠杆菌中诱导表达dsRNA并进行纯化，通过对黄粉虫幼虫注射dsRNA，抑制了黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp的表达。抗冻蛋白基因编码的小分子蛋白质对提高昆虫耐寒性具有重要作用，被认为是许多昆虫重要的越冬策略［16］。由于新近发现抗冻蛋白具有抗冻之外的其他功能［11］，因此抗冻蛋白RNA干扰质粒的成功构建表达，有助于进一步研究其功能。抗冻蛋白基因是一个超基因家族，存在众多亚型。拟步甲科昆虫抗冻蛋白具有特殊的“TCTXSXXCXXAX”（其中X为任意氨基酸）重复序列，其数目不同构成不同的异构体（isoform），故保守性较高［17］。对黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433（AF160497）序列分析发现，其与黄粉虫其他afp基因具有81%-99%的一致性（identity），所以Tmafp433基因相应的dsRNA有可能沉默所有Tmafp基因的表达。这对于通过RNAi研究抗冻蛋白的功能非常有利。根据Tmafp433的ORF序列在线预测了可能存在的siRNA位点，选择其中408 bp序列作为RNA干扰片段，并加入BglII和PstI两个酶切位点，以便构建至L4440干扰载体。此外，我们在黄粉虫afp基因5'端高度保守的信号肽编码区域设计了实时荧光定量PCR引物，可以检测RNA干扰后黄粉虫体内afp基因家族的表达水平。

L4440干扰载体含有两个相反方向的T7聚合酶启动子及lac乳糖操纵子，可通过IPTG诱导表达dsRNA。大肠杆菌HT115（DE3）菌株为dsRNA特异的核酸内切酶（RNase III）缺陷型菌株［18］，利用L4440载体构建的L4440-Tmafp 重组质粒转化HT115（DE3）菌株，通过IPTG诱导实现了特异dsRNA的表达。为获得纯度较高的dsRNA，对提取的诱导后细菌总RNA进行消化。其中利用DNase I消化总RNA中的单链或双链DNA而不影响单链或双链RNA，利用RNase A可特异性攻击RNA上嘧啶残基的3'端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键［19］，而对双链的DNA和RNA不起作用的特性来消化RNA，从而达到纯化dsRNA的目的。

黄粉虫经PBS、W-dsRNA和Tmafp-dsRNA注射后均出现死亡，其中PBS和W-dsRNA注射组的死亡率显著低于Tmafp-dsRNA注射组，而与未注射组无差异，这可能是由于注射对黄粉虫造成伤害，从而导致死亡。注射Tmafp-dsRNA后黄粉虫的死亡率较高，可能一方面是由于注射导致，另一方面则是因为Tmafp-dsRNA诱发RNAi，抑制了黄粉虫afp基因的表达，影响了其正常的生理代谢。RNAi的效果因物种不同、靶基因不同或dsRNA的递送方式不同而不同。如对长红猎蝽（Rhodnius prolixus）注射15 μg dsRNA可降低（75±14）%的唾液腺携带亚铁红素蛋白2基因表达，而饲喂13 μg dsRNA则仅降低基因（42±10）%的表达［20］。在鞘翅目昆虫赤拟谷盗（Tribolium castaneum）［21］、玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera virgifera）［22］等昆虫中均通过注射dsRNA的方式取得很好的RNAi效果。而通过对黄粉虫幼虫注射纯化后的Tmafp-dsRNA，检测Tmafp基因mRNA水平的变化时发现其表达受到显著抑制，比为注射组下降了60.8%，表明所合成的Tmafp-dsRNA可有效地发挥干扰作用。对拟步甲科的赤翅甲（Dendroides canadensis）afp基因沉默后，其热滞活性显著降低［23］，而昆虫热滞活性的高低与其耐寒性密切相关。同时也发现，对黄粉虫注射PBS和W-dsRNA后，其afp表达量显著高于未注射组，类似的情况在赤翅甲中也有发现［23］，这可能是由于注射对黄粉虫造成伤害，引起了黄粉虫的应激反应，从而导致afp基因的上调表达，这与我们发现荒漠甲虫抗冻蛋白基因表达受环境因素胁迫诱导具有一致性［11，24，25］。这也许提示抗冻蛋白在体内具有应急响应功能，因此我们对抗冻蛋白功能的认识还十分有限。抗冻蛋白基因在昆虫受到干旱、热激等非生物胁迫时表现的上调表达［11，26］，提示抗冻蛋白可能与昆虫抵抗环境胁迫有密切关系。

4 结论

利用大肠杆菌HT115特异表达了黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433相应的dsRNA，经提取纯化后注射黄粉虫，对其afp基因进行RNA干扰。结果表明细菌表达的Tmafp-dsRNA对黄粉虫抗冻蛋白基因的表达具有明显的抑制作用，这为大规模干扰黄粉虫afp基因，详细研究其功能奠定了基础，同时有利于进一步开展afp基因与昆虫非生物胁迫的关系研究。

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（责任编辑 李楠）

RNA Interference of Antifreeze Protein Gene in Tenebrio molitor Mediated by Bacterially Expressed dsRNA

Shi Meng Liu Xiaoning Ma Ji
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

In order to further study the non-freezing function of antifreeze protein（AFP）genes in Tenebrio molitor using RNAi technology, the RNAi fragment of Tmafp433 from T. molitor was inserted into L4440 dsRNA expression vector, and transformed into E. coli HT115（DE3）. The dsRNA corresponding to Tmafps, designated as Tmafp-dsRNA, was expressed by IPTG induction, and injected into the larvae after purification. The mRNA level of Tmafps was detected using real-time quantitative PCR. The results showed that the E. coli HT115（DE3）containing L4440-Tmafp recombinant plasmid can express Tmafp-dsRNA. After 24 h of injection, the expression of Tmafps in T. molitor was significantly decreased to 60.8% of the control, suggesting that the expression of Tmafps was inhibited by injecting the bacterially expressed Tmafp-dsRNA. The present results laid foundation for further research in afp gene function.

Tenebrio molitor afp gene RNA interference Double-stranded RNA L4440 vector

2014-01-18

国家自然科学基金项目（31360527），新疆生物资源基因工程重点实验室开放课题（XJDX0201-2014-03）

石萌，女，硕士研究生，研究方向：昆虫分子生物学；E-mail：12721464@qq.com

马纪，博士，教授，研究方向：昆虫低温分子生物学；E-mail：majiuci@xju.edu.cn