不同铵硝比例对杭白菊次生代谢及抗病性的影响

张 朋， 王康才*， 赵 杰， 赵秀梅， 郭庆海， 陈志祥

(1 南京农业大学中药材研究所， 江苏南京 210095； 2 江苏省盐城市滨海县植保植检站， 江苏滨海 224500；3 江苏省盐城市射阳县盛大药材有限公司， 江苏射阳 224300)

1 材料和方法

1.1 试验设计

试验在南京农业大学校内试验基地进行，供试材料由洋马中药材种植基地提供。2013年6月选取生长一致，无病虫害的健壮植株定植于花盆，每盆1株，花盆规格为35 cm×30 cm，基质为蛭石和珍珠岩，比例为(1 ∶2)，每盆装基质约25 L。

另外，在整个生育期内每盆所施过磷酸钙，氯化钾总量分别为7.698 g和1.353 g，其中过磷酸钙采用一次性基施，氮肥和钾肥则分别于6月初、 7月下旬、 9月初按底肥40%、 打顶分枝肥40%、 蕾肥20%分3次施入。为了保证试验材料正常生长，在原有施肥方案的基础上采用一次性基施的方式补充中、 微量元素(见表1)。试验采用随机区组设计，管理措施一致，4次重复。

表1 补充施用中、 微量元素情况(g/pot)

1.2 测定项目和方法

1.2.1 病害调查方法 2013年9月中下旬，观察杭白菊斑枯病发病情况，各处理采取对角线定点定株调查，每隔5 d调查一次，每个处理调查5株。

1.2.3 杭白菊中总黄酮、 绿原酸、 木犀草苷、 3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸的测定 2013年9月底分别选取不同处理的根、 茎、 叶、 花洗净，105 ℃杀青30 s，置DHG90A电热恒温干燥箱中75 ℃烘至恒重，打粉过0.3 mm筛。总黄酮采用超声提取，比色法测定；绿原酸、 木犀草苷、 3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸等成分按照2010版药典[8]的方法进行测定。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2007和统计软件SPSS 19.0进行统计分析，LSD法检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同铵硝比例对杭白菊斑枯病发病率及病情指数的影响

表2 不同铵硝比例对菊花蕾期斑枯病发生情况的影响(%)

2.2 不同铵硝比例对杭白菊叶片中木质素、 纤维素、 可溶性总糖、 可溶性蛋白含量的影响

表3 不同铵硝比例对杭白菊叶片木质素、 纤维素、 可溶性总糖、 可溶性蛋白含量的影响

2.3 不同铵硝比例对杭白菊病叶中苯丙氨酸解氨酶(PAL)和抗氧化酶的影响

表4 不同铵硝比例对杭白菊叶片PAL和抗氧化酶的影响

2.4 不同铵硝比例对杭白菊病叶中丙二醛和超氧阴离子含量的影响

2.5 不同铵硝比例对杭白菊不同部位总黄酮含量的影响

表5 不同铵硝比例对MDA和的影响

2.6 不同铵硝比例对绿原酸、 木犀草苷、 3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸含量的影响

表6 不同铵硝比例对杭白菊不同部位总黄酮含量的影响(mg/g)

表7 不同铵硝比例对杭白菊绿原酸、 木犀草苷和3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸含量的影响(%)

2.7 相关生理指标与发病率和病情指数的相关分析

相关性分析结果(表8)表明，杭白菊的木质素、 可溶性总糖、 苯丙氨酸解氨酶(PAL)、 过氧化物酶(POD)活性、 超氧阴离子、 绿原酸、 3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸、 花中总黄酮的含量与杭白菊斑枯病的发病率和病情指数呈负相关，且达极显著水平(P<0.01)；SOD活性、 MDA含量与杭白菊斑枯病的发病率和病情指数呈正相关，且均达显著水平(P<0.05)或极显著水平；纤维素、 可溶性蛋白、 木犀草苷和根中总黄酮含量与发病率和病情指数有一定的相关性但均不显著；综合方差分析和相关性分析的结果，认为杭白菊斑枯病的发病率和病情指数与相关生理指标和次生代谢密切相关。

表8 杭白菊相关生理指标与发病率和病情指数的相关分析(n=15)

3 讨论

3.1 不同铵硝比例对杭白菊斑枯病及木质素、 纤维素、 可溶性总糖等物质的影响

植物在长期的进化过程中，在与病原菌相互作用中通过各种代谢途径和形式建立了有效应对外来侵害的完整机制，例如形态结构屏蔽、 抗氧化酶、 抗病物质等。

木质素与植物的抗病性密切相关，木质素含量的增加提高了寄主植物的抗性，阻碍了病原菌对植物的进一步侵染[9]。纤维素在维持植物细胞的形态、 抵抗病害方面也发挥了重要的作用。本研究发现在病害胁迫下，随着硝态氮比例的增加，木质素、 纤维素含量呈先上升后下降的趋势，斑枯病的发病率也随之降低，这与骆桂芬等[10]木质素含量增加降低霜霉病发生率，李淼等[11]对木质素含量与抗病性呈正相关的研究结果相一致。

3.2 不同铵硝比例对杭白菊斑枯病及保护酶物质的影响

过氧化物酶(POD)是与植保素、 木质素等物质的生物合成有关的一类氧化酶[14]，POD 可以将酚类物质氧化为醌类物质，清除活性氧，提高植物的抗病能力。本研究发现，在病害胁迫下随着硝态氮比例的增加杭白菊病叶中POD的活性先升高后下降，斑枯病的发病率随之下降。这说明不同铵硝比例或许是通过影响病害胁迫下POD的含量来影响植物病害的发生。

丙二醛(MDA)是不饱和脂肪酸降解的末端产物，其含量可作为膜脂过氧化程度的一个重要指标。本研究发现在病害胁迫下随着硝态氮比例的增加杭白菊病叶中MDA的含量呈先下降后上升的趋势，且单施硝态氮时MDA含量较低，与植株的病害发生情况相一致。这与翟彩霞等[20]的研究结果一致

3.3 不同铵硝比例对杭白菊斑枯病及次生代谢产物的影响

黄酮类化合物与植物的抗病性关系密切，参与组织和病原微生物的互作及防御反应，具有抗病毒，抑菌活性，可作为植保素在植物体内累积使植物免受微生物的侵染[21]。本研究发现在病害胁迫下随着硝态氮比例的增加，植物体内黄酮含量随之增加，发病率逐步下降，这也许是因为氮素会对黄酮合成过程中的关键酶PAL产生影响，苯丙氨酸是蛋白质和酚类化合物合成的共同前体，酚类与蛋白质之间存在竞争关系，在病害影响下施入硝态氮会使苯丙氨酸向蛋白方向转化减少(这也是本试验中蛋白含量随硝态氮比例增加而有所减少的一个原因)，导致PAL活性增强，即黄酮转化的前体含量增加，从而使黄酮含量增加，并最终通过影响黄酮含量来影响植物病害的发生。

酚类物质是抗菌性物质，有一定的毒性在植物体内可抑制病原物分泌的水解酶起到抗菌作用，它又是木质素合成的前体，使木质化增强。在植物抗病过程中起重要作用，提高植物的抗病性[22]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)与植物体内苯丙烷类代谢和大多数酚类物质的合成密切相关，PAL是其合成过程中的关键酶，PAL 活性增强，植物体内酚类物质如绿原酸等含量增多，同时 PAL 也是调控植物过敏性反应的主要酶系之一。本研究发现在病害胁迫下随着硝态氮比例的增加，PAL、 绿原酸、 3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸均出现先上升后下降的趋势，而植株的发病率也随之有所降低。这说明不同铵硝比例或许是通过影响病害胁迫下PAL活性、 绿原酸、 3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸含量来影响植物病害的发生。这与王萱[23]的研究结果PAL活性与抗病性呈正相关，郭莹等[3]铵态氮促进大白菜芝麻状斑点病发生的作用高于硝态氮和酰胺态氮的研究结果一致，与叶茂炳等[24]的研究小麦麦穗接种病原菌以后，PAL比活力变化以及绿原酸含量与其抗赤霉病程度呈负相关不一致，这可能是病原菌以及植物类别不同等原因所致。

参考文献:

[1] Huber D M, Waston R D. Nitrogen form and plant disease[J]. Annual Review Phytopathology, 1974, 12, 139-165.

[2] Sandor S. Snoeijers, Alejandro Pérez-Garcíaetal. The effect of nitrogen on disease development and gene expression in bacterial and fungal pathogens[J]. European Journal of Plant Pathology, 2000, 106 (6)：493-506.

[3] 郭莹, 杨晓云, 司朝光, 等. 不同形态氮素营养对大白菜芝麻状斑点病发生的影响[J]. 园艺学报, 2011, 38(8)：1489-1497.

[4] 张国珍, 程惠珍, 丁万隆. 氮素形态对西洋参黑斑病的影响[J]. 中国中药杂志, 1998，23(1)：17-18, 61.

Zhang G Z, Cheng H Z, Ding W L. Effects of nitrogen form on American Ginseng Leaf Blight[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 1998, 23(1)：17-18, 61.

[5] 李灿雯, 王康才, 吴健, 等. 氮素形态对半夏生长及生物碱和总有机酸累积的影响[J]. 植物营养与肥料学报, 2012, 18(1)：256-260.

Li C W, Wang K C, Wu Jetal. Effects of nitrogen form on the growth and accumulation of total alkaloid and free organic acids of Pinellia ternate[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2012, 18(1)：256-260.

[6] 中国标准出版社第一编辑室, 农药管理与使用标准汇编[M]. 北京：中国农业出版社， 2002.

Chinese Standard Press the Newsroom. Pesticide management and use of standard assembly[M]. Beijing：Chinese Agriculture Press, 2002.

[7] 高俊凤. 植物生理学实验指导[M]. 北京：高等教育出版社, 2005. 219-221.

Gao J F. Plant physiology experiment instruction[M]. Beijing：Higher Education Press, 2005. 219-221.

[8] 中国药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京：化学工业出版社, 2010. 76.

Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopoeia[M]. Beijing：Chemical Industry Press, 2012. 76.

[9] Carver T L W, Zeyen R J, Bushnell W R, Robbins M P. Inhibition of phenylalanine ammonialyase and cinnamyl-alcohol dehydrogenase increases quantitative susceptibility of barley to powdery mildew (Erysiphe graminis DC)[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1994, 44(4)：261-272.

[10] 骆桂芬，邹艳华，张伟. 黄瓜叶片中木质素含量与抗霜霉病的关系[J]. 吉林农业大学学报, 1995, 17(2)：18-21.

Luo G F, Zou Y H, Zhang W. Relationship bewteen ligin conetnt in cucumber leaves and resistance to paeudoperonospora cubensis[J]. Journal of Jilin Agricultural University, 1995, 17(2)：18-21.

[11] 李淼, 檀根甲, 李瑶, 等. 猕猴桃品种中糖分及木质素含量与抗溃疡病的关系[J]. 植物保护学报, 2005, 32(2)：138-142.

Li M, Tan G J, Li Yetal. Relationship bewteen contents of lignin and soluble sugar in plants of kiwifruite cultivars and their risistance to kiwifruite bacterial canker infected byPseudomonasyringaepv. actinidiae[J]. Acta Phytophylacica Sinica, 2005, 32(2)：138-142.

[12] Horsfall J G, Cowling E B. Plant disease：an advanced treatise,Vol..5. How plants defend themselves[M]. New York：Academic Press, 1980.

[13] 刘赵帆, 张国斌, 郁继华, 等. 氮肥形态及配比对花椰菜产量、 品质和养分吸收的影响[J]. 应用生态学报, 2013, 24(7)：1923-1930.

Liu Z F, Zhang G B, Yu J Hetal. Effects of nitrogen form on the yield, quality and nutrient absorption of broccoli[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2013, 24(7)：1923-1930.

[14] Christensen J H, Bauw G, Welinder K Getal. Purirication and characterization of peroxidases correlated with lignification in poplar xylem[J]. Plant Physiology, 1998, 118(1)：125-135.

[15] Mehdy M C. Active oxygen species in plant defense against pathogens[J]. Plant Physiology, 1994, 105(2)：467-472.

[16] 宋凤鸣, 郑重, 葛秀春. 活性氧及膜脂过氧化在植物-病原物互作中的作用[J]. 植物生理学通讯, 1996, 32(5)：377-385.

Song F M, Zheng Z, Ge X C. Role of reactive oxygen species and membrane lipid peroxidation in plant-pathogens- interactions[J]. Plant Physiology Communications, 1996, 32(5)：377-385.

[17] Montalbim P, Buonaurio R. Effect of tobacco mosaic virus infection on leaves of soluble superoxide dismutase (SOD) inNicotianatabacumandNicotianaglutinosaleaves[J]. Plant Science, 1986, 47(2)：135-143.

[18] Zacheo G, Zacheo T B. Involvement of superoxide dismutase and superoxide radicals in the susceptibility and resistance of tomato plants toMeloidogymeincognitaattack[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1988, 32(2)：313-317.

[19] 陈捷, 蔺瑞明, 高增贵, 等. 玉米弯孢斑枯病菌毒素对寄主防御酶系活性的影响及诱导抗性效应[J]. 植物病理学报, 2002, 32(1)：43-48.

Chen J, Lin R M, Gao Z Getal. The influence ofCurvularialunatatoxin on defense enzyme activities and its function in the induced resistance of corn[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2002, 32(1)：43-48.

[20] 翟彩霞, 马春红, 王立安, 等. 玉米在诱导抗病过程中丙二醛 (MDA)含量的变化[J]. 玉米科学, 2005, 13(1)：77-82.

Zhai C X, Ma C H, Wang L Aetal. The change of malondialdehyde concentration on course of the induced disease- resistance in corn[J]. Journal of Maize Sciences, 2005, 13(1)：77-82.

[21] 黄璐琦, 王康才. 药用植物生理生态学[M]. 北京：中国中医药出版社, 2012. 249.

Huang L Q, Wang K C. Medicinal plant physiological ecology[M]. Beijing：China Press of Traditional Chinese Medicine, 2012. 249.

[22] 李云锋, 王振中, 贾显禄. 稻瘟菌激发子 CSBⅠ诱导水稻防御性相关酶的活性变化[J]. 作物学报, 2004, 30(6)：613-617.

Li Y F, Wang Z Z, Jia X L. Activity dynamics of related defense enzymes induced by an elicitor CSBⅠfrom magnaporthe grisea[J]. Acta Agronomica Sinica, 2004, 30(6)：613-617.

[23] 王萱. 辣椒白粉病抗性与苯丙氨酸解氨酶活性的关系[J]. 中国农学通报, 2009, 25(3)：193-196.

Wang X. Relationship between resistance to leveillula taurica and PAL activity in pepper[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2009, 25(3)：193-196.

[24] 叶茂炳, 徐朗莱, 徐雍皋, 等. 苯丙氨酸解氨酶和绿原酸与小麦抗赤霉病性的关系[J]. 南京农业大学学报, 1990, 13(3)：103-107.

Ye M B, Xu L L, Xu Y Getal. Relationship between resistance of wheat to scab and activities of phenylalanine ammonia lyase and amount of chlorogenic acid[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 1990, 13(3)：103-107.