质谱方法在过敏原研究中的应用

赵璟源，贺艳，张裕君，郑文杰，宋喆，许泓

（天津出入境检验检疫局，天津300461）

过去10年，食品过敏的情况在世界范围日益普遍。发达国家有超过20%的人受过敏性疾病的困扰[1]，美国每年约有2%～5%的人发生食品过敏，其中儿童及婴儿的发病率较高，约为5%～8%。我国食品过敏发病率高于发达国家。中国疾控中心与食品安全所的调查表明，在15 岁～24 岁年龄段健康人群中，约有6%的人曾患有食品过敏。尽管食品过敏在儿童和成人间日益流行，但没有应对措施，因而在食品标签上标明过敏原的存在是避免过敏患者食入潜在过敏原的最有效的途径。已经有行业标准采用酶联免疫方法和实时荧光PCR 方法检测食品中过敏原成分，但存在一些不足，质谱技术的发展，为过敏原的研究提供了新的手段。

1 食品过敏原

1.1 食品过敏原种类

食品过敏原指那些能对特定人群产生免疫反应或过敏反应的食品中的蛋白质。已知结构的过敏原都是蛋白质或糖蛋白，大部分过敏原分子量介于10 000 u～70 000 u 之间，占食品总蛋白的极小一部分，但是微量的食品过敏原蛋白即可引起严重的过敏反应。蛋类、花生、牛奶、大豆、小麦、树木坚果、鱼类和甲壳类食品是常见的过敏原食品。90%以上的过敏反应由这些致敏食物引起。

1.2 过敏原发病机制

过敏原进入机体后，会引起机体发生正常的或过度的免疫应答，通常称过度的免疫应答为过敏反应。过敏反应分为I～IV 型，食品过敏为I 型过敏反应，90 %以上是由IgE 抗体介导的，少数为非IgE 介导。在IgE介导的食品过敏中，当易感人群初次摄入食品过敏原后，机体会产生相当量的IgE 抗体，这种IgE 抗体具有亲细胞的特征，能与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合，当相同过敏原再次入侵时，与上述细胞表面的IgE 抗体特异的结合，所形成的过敏原-IgE 复合物能够激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞并使之脱颗粒，然后从排除的颗粒中及细胞内释放一系列生物活性介质，而引起毛细血管扩张、血管壁通透性增加、平滑肌收缩和腺体分泌增多。在临床上可表现为荨麻疹、休克、哮喘、腹痛和腹泻等多种症状[2]。

2 质谱方法在过敏原研究

离子源和质量分析器是MS 技术研究蛋白质的核心。基质辅助激光解吸电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）是最广泛使用的软电离手段。MALDI 和ESI 可以与各种质量分析器联用。目前，有4种常用的质量分析器：四级杆（Q）、离子阱（QIT 三维离子阱/LIT 线性离子阱）、飞行时间（TOF）、傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）质量分析器[3]。随着生物质谱（MS）技术的快速发展，蛋白质和多肽分析的分辨率、灵敏度、准确性、鉴定能力大为提高。质谱的发展使得该技术可以应用于过敏原蛋白的研究及检测方法建立。

2.1 质谱方法作为过敏原研究的技术

目前基于质谱技术分析组蛋白及其翻译后修饰主要有两种策略：bottom-up 和top-down.Bottom-up策略通常是将提纯后的组蛋白酶解成多肽，然后用液相色谱和串联质谱技术（LC/MS/MS）分析酶解多肽，最后采用生物信息检索分析多肽序列和修饰位点。Top-down 策略通常是将组蛋白直接引入到质谱中进行分析，通过碎片裂解技术将组蛋白裂解成多肽的碎片分子，得到蛋白质和碎片离子的质量，最后采用生物信息检索推演多肽序列和修饰位点。常见的碎片离子裂解技术主要有：碰撞诱导解离（CID/CAD）电子捕获解离（ECD）电子转移解离（ETD）等[3]。通常食品中含有复杂的基质，在进行质谱分析前需要对蛋白质进行纯化。常用的纯化方法有SDS-PAGE 方法和二维电泳的方法。通过考马斯亮蓝、银染等看到蛋白质。然后切胶，再用胰酶处理，再通过质谱鉴定。罗春萍等结合SDS-PAGE、MALDI-TOF/MS 和Western blotting 鉴定了花生过敏原Ara h 6[4]。

质谱法与圆二色谱的方法相结合可应用于过敏原的过敏机制研究。Iris Lauer 对Cor a 11 的分子学特征进行研究，SDS-PAGE 和MALDI-TOF MS 结果表明Cor a 11 的2 个潜在糖基化作用部位中的一个是糖基化的，圆二色谱表明重组和自然Cor a 11 拥有相似的二级结构。与其他几个榛子过敏原比较致敏性，通过对65 名榛子过敏患者进行体外测试，研究重组Cor a 11、Cor a 1、Cor a 2、Cor a 8 的IgE 致敏模式，得到结论，榛子豌豆球蛋白Cor a 11 的IgE 反应患病率在50 %以下。与Cor a 1 相比，1 000 倍浓度的Cor a 11 可以诱导相似的嗜碱细胞介体释放[5]。胡纯秋等从花生中提取Ara h 2，并用SDS-PAGE 和MALDI-TOF-MS 鉴定。用酶联免疫吸附试验（ELISA）、圆二色谱（CD）荧光和紫外吸收谱衡量热处理对Ara h 2 抗原性和结构的影响。结果表明Ara h 2 抗原性在加热至55 ℃和70 ℃有轻微的提高，在85 ℃以上时，抗原性明显下降，并随温度上升不断下降。CD 表明热处理后Ara h 2 二级结构被改变。紫外吸收光谱表明除了50 ℃30 min 的样品外，Ara h 2 在被加热后最大吸收波长均有提高。因此，得出Ara h 2 的构象变化导致了抗原性的下降[6]。Lauer Iris等通过研究重组榛子过敏原，得到的蛋白利用快速蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatography，FPLC）两步法纯化，IgE 抗体反应性被验证。通过N-末端测序和MALDI-TOF-MS 分析来验证特征。用圆二色谱和NMR 来确定二级和三级结构。可利用这种重组的榛子过敏原进行体外测试诊断，研究过敏原特征[7]。

吴海强等将花生总蛋白2-DE 指纹图谱与蛋白点MALDI-TOF/MS 分析联用，发现其中共有178 个特征性蛋白点，并得出结论，每个蛋白斑点都有各自的摩尔分子量和不同的MALDI-TOF/MS 图谱[8]。Hird H 等利用原生双向电泳检测榛子过敏原，用坚果过敏患者的血清进行免疫印迹分析，可以使有相同等电点和分子质量的花生和榛子过敏原得以鉴定。通过基质辅助激光解析/离子化质谱法（MALDI-MS）得到这2种蛋白的分子量为4 826 u[9]。

Schmidt H 等分别用单向和双向电泳对弗吉尼亚型花生和印尼花生的基本提取物进行比较。通过质谱方法，在这些提取物中发现了一百多种不同成分，并得到了包含目前未知片段的主要花生过敏原的高分辨率图谱。结果表明在各种印度尼西亚花生中Ara h 1水平的下降与Ara h 2 的丰度降低有关，用单克隆抗体和过敏患者血清的Western blotting 得到相同结果[10]。

Kottapalli K R 等用双向电泳和nESI-LC-MS/MS方法研究了从NewMexico Valencia C（NM Valencia C），Tamspan 90，Georgia Green，及NC-7 这4 个花生品种的成熟种子中分离的总种子蛋白。先用硝酸银染色的双向电泳得出4种花生中分别有457、516、556、530 个蛋白斑点，用nESI-LC-MS/MS 分析20种显示出相对丰度差别的大量蛋白斑点，鉴别出14种非冗余蛋白。这些蛋白中的大部分属于由花生球蛋白和伴花生球蛋白种子贮存蛋白以及其他过敏原蛋白组成的球蛋白。一些确定的蛋白斑点的表达具有品种特定性，例如，过敏原Ara h 3/Ara h 4 和伴花生球蛋白斑点只在Tamspan 90 和NC-7 中检测到，而Gly1 蛋白斑点只在New Mexico Valencia C 和NC-7 中检测到。表明可以利用2-DE 和nESI-LC-MS/MS 检测特定花生过敏原的存在[11]。White B L 等用nanoLC-MS/MS 测序对花生种皮蛋白质组分析，来研究蛋白质组成和潜在过敏性。在去皮的种子和种皮中总共有123 个蛋白质被鉴定，其中83 个是两个部分都存在的。除了38 个在种子中不存在的蛋白，种皮中含有所有已知的花生过敏原[12]。

Hebling C M 等使用使用凝胶洗脱液相组分截留电泳技术（gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis，GELFREE）根据蛋白质分子量的不同，对完整蛋白质进行分组，并结合LC-MS/MS 平台对原料花生进行球蛋白组表征。这种方法提高了独特肽标识的数量，提供蛋白异构体的直观图[13]。

2.2 质谱方法作为过敏原检测方法

目前过敏原的检测方法有很多。最常用的过敏原检测方法是实时荧光PCR 的检测方法，以过敏原物质的DNA 为检测目标，通过分析确定DNA 序列上一段核苷酸片段作为过敏原的检测标志[14]。尽管实时荧光PCR 方法通过NCBI 检索能够很好地保证结果的准确性，可是由于实时荧光PCR 方法的检测目标是DNA，而引起过敏反应的通常是蛋白质，在检测中即便是检测到样品中含有过敏原的DNA，但并不代表该样品中含有过敏原的蛋白质。

以蛋白质为检测目标的方法有酶联免疫（ELISA）和试纸条方法，这些方法主要是基于抗原抗体的特异性反应。酶联免疫检测方法是半定量检测方法，其检测限（LOD）通常在。ELISA 检测方法的局限在于与抗体结合的抗原决定簇通常研究不深入，而且有一部分是蛋白质空间构象，因此热加工和机械加工均有可能影响抗原决定簇，从而会导致ELISA 检测过程中出现假阴性的结果。质谱技术可以是DNA 检测方法和酶联免疫方法的有益补充。

由于蛋白质或肽段的离子化效率受很多的物理化学因素（如分子的大小，电荷数量，极性等）的影响，因此，采用MS 技术定量需要对应的标准品作为参照物质。依据top-down 策略，完整蛋白的直接定量是将带多电荷离子的信号强度与内源或者外源的标准相比。然而，top-down 质谱方法的灵敏度往往因为蛋白质带电量不同而受限。因此bottom-up 策略即鸟枪方法更多地应用于过敏原质谱的检测和定量。蛋白质组学中定量分析越来越多地应用bottom-up 的方法。定量分析方法如DILAC，ICAT，ITRAQ 或者非标记方法能够用于复杂样品中整个蛋白质的分析[15-16]。然而上述策略适合于目标分析物是差异表达蛋白质。

串接质谱的SRM 检测方式目前为复杂样品中目标蛋白准确定量最好的方法[17]。SRM 在蛋白质组学中的应用更多地依赖于稳定的isotopedilution（SID）方法[18]，实际SRM 和SID 不是新技术，早在70年代晚期就已经在小分子的定量分析中使用。与蛋白质组学结合后，得到越来越多的应用，因此可以认为是绝对定量的“金标”。这种对目标前体离子与对应产物离子的监测，避免了“蛋白水解肽段”方法大量的主要成分的干扰，使定量的重现性得以提高。基于质谱的绝对定量方法需要用到内源参考肽段。比如：用LC-MS/MSSRM 检测食品中花生的Ara h 2 和Ara h 3/4 蛋白质时，选用亮氨酸-脑啡肽作为内源[19]。张伟等确定酪蛋白的3 个不同亚型的特征肽段分别为：β 酪蛋白的特征性肽段为：AVPYPQR 和VLPVPQK，αs1 酪蛋白的特征肽段为YLGYLEQLLR 和FFVAPFPEVFGK，αs2 酪蛋白的特征性肽段为：ALNEINQFYQK 和FALPQYLK[20]。

Parisa Ansari 等Lock Stephen J.等通过提取榛子蛋白Cor a 8、Cor a 9、Cor a 11，选定榛子特有的肽段[21-22]。Chassaigne H 等开发了毛细管液相色谱（capillary LC）与纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质谱（nano-ESI QTOF MS/MS）结合的方法，来确定那些可以作为花生过敏原标记的肽，着重确定主要花生过敏原Arah1，Ara h 2，和Ara h 3。所得的分析数据与de novo 测序组合，进行数据库搜索，并用于以上3种花生过敏原的大量序列标签的鉴定。通过分析花生原料和烤花生，可以鉴定作为特定过敏原蛋白标记的5种花生特定序列标签。对Arah1，发现两个标记肽链，即VLEENAGGEQEER（m/z 786.88，charge 2+）和DLAFPGSGEQVEK （m/z 688.85，charge 2+）；对Ara h 2，发现一个满足所需条件，为RQQWELQGDR（m/z 439.23，charge 3+）；对Ara h 3，特异性的肽链是SPDIYNPQAGSLK （m/z 695.35，charge 2+）和SQSENFEYVAFK（m/z 724.84，charge 2+）。其他的肽链已经被提出作为食品加工的标记[23-25]。

质谱方法在开发成为过敏原检测方法过程中需要考核质谱方法在不同的食品基质中的基质效应，回收率，检测低限，定量限等指标。红葡萄酒在澄清过程中需要加入酪蛋白作为澄清剂，红葡萄酒含有大量的丹宁等鞣质，传统蛋白质提取方法（超滤、透析、有机溶剂沉淀等）用于葡萄酒时回收率只有20%～30%，而十二烷基硫酸钾（KDS）法、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）法提取后蛋白仍需要去除丹宁和两性解电质，工作量大，分析通量低，蛋白质的回收率很低[26-28]。交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）能够有效去除丹宁，结果表明用液相色谱-串联质谱分析酪蛋白的回收率提高到80%以上，检出限达10 μg/L。冰激淋中往往会添加花生作为风味物质。含有各级别花生蛋白的冰淇淋样品可用50 kDa 的超滤膜可有效提高Ara h 1 回收率，低至10 mg/kg 的Ara h 1 可被反相液相色谱串联质谱（RPLC/MS/MS）法常规检测[23-24]。类似的方法应用于黑巧克力作为模型食品基质的花生过敏原研究，预提取消化（20 mg/kg）比后提取消化（50 mg/kg）显示出更好的检出限。通过三重四级杆和多反应监测模式（MRM）可将检出限进一步减少到10 mg/kg。提取技术的改善结合提取的巧克力的数量增加（1 g），可将检出限提高到2 mg/kg 花生蛋白[29]。大米脆皮和巧克力相关小吃作为模型食品基质，开发了基于过敏原蛋白生物标志物肽段的液相色谱电喷雾串联质谱（LC-ESIMS-MS）检测方法来确定并定量食品中的花生过敏原。结果表明此方法对Ara h 2 和Ara h 3/4 有良好的检出限，分别是5 μg/g 和1 μg/g，此类食品中花生蛋白线性在10 μg/g ～200 μg/g 范围。通过分析树木果仁（杏仁、山核桃、榛子、核桃）和食品成分如牛奶、大豆、巧克力、玉米片、米制脆皮，证明了这项方法的选择性[30]。Careri M 等开发了从早餐谷物中分离痕量花生过敏原Ara h 3/4 的选择性免疫磁珠提取步骤，并结合了微波辅助蛋白质提取和LC-ESI-IT-MS/MS 的方法。通过蛋白A 包被磁珠辅助，抗Ara h 3/4 单克隆抗体作为筛选捕获分子。LC-ESI-IT-MS/MS 得到的检测限为3 mg/kg，另外，明显的抑制基质效应表明抗体包被磁珠能对早餐麦片中的Ara h 3/4 蛋白进行有效的选择性捕捉[31]。

Bignardi C 等在利用液相色谱电喷雾线性离子阱串联质谱（LC-ESI-LIT-MS/MS）检测麦片和饼干中花生及其他坚果类过敏原。此方法可对麦片和饼干中5种坚果过敏原（Ana o 2，腰果；Cor a 9，榛子；Pru 1，扁桃仁；Ara h 3/4，花生；Jug r 4，胡桃）同时分析。在此过程中，从峰值形状、分离度、分析时间和选择性几方面比较填C18 充柱和硅整体柱的性能。C18 填充柱表现出更高的性能，得到基质良好匹配标定曲线，检测极限在14 mg/kg ～55 mg/kg 范围。回收率在（76±4）%到（94±3）%范围内，RSD ＜15%[32]。

对花生或者含有花生的食品进行热加工（例如烘焙）会引起复杂的化学反应，从而改变花生蛋白的结构构象，阻碍利用免疫化学的方法对过敏原的精确检测，但对质谱方法检测过敏原没有影响。Hebling C M等改变了传统的花生蛋白提取方法，包括蛋白变性剂和增溶剂。通过SDS-PAGE 和Western blot 对原料及烘焙花生提取物进行定量表征分析，确定总蛋白回收率有所提高，并为Ara h 1，Ara h 3 的结合提供了证据，较轻程度的Ara h 2 在烘焙后形成高摩尔分子量的蛋白复合物。用HPLC-MS/MS 对花生裂解物中的过敏原相对定量，将原料和烘焙花生对MS 有差别反应的过敏原肽段作为热变性的候选目标[33]。用HPLC-MS/MS 鉴定赖氨酸修饰的美拉德糖基化终末产物，确定了在烘焙花生品种中羧甲基赖氨酸（CML）、羧乙基赖氨酸（CEL）和pyrraline（Pyr）对Ara h 1 及Ara h 3 胰蛋白酶消化肽段的蛋白质修饰[34]。

此外，CareriM 等基于ICP-MS，通过使用铕标记的抗体，检测低量的花生（低至接近2 mg 花生/千克谷物基质）。富含蛋白的原料缺少可检测的交叉反应，证明了选择性[35]。CareriM 等选取巧克力大米脆皮点心作为食品基质，比较铕标记ICP-MS 免疫法与LC/ESI-MS/MS 在花生过敏原检测方面的性能。ICP-MS 检测Ara h 2 和Ara h 3/4，检测限分别为2.2 μg/g 和5 μg/g，回收率范围是（86±18）%到（110±4）%，线性范围是5 μg/g～50 μg/g。LC/MS/MS 方法得到Ara h 3/4 和Ara h 2 的检出限分别是1 μg/g 和5 μg/g，表现明显的高值，得到线性范围为10 μg/g～200 μg/g，RSD ＜10%表明良好的精度[36]。

3 结语

食品过敏在儿童和成人间日益流行，但没有措施应对，避免接触是主要的治疗模式，因此，研究人员必须克服障碍，处理复杂食品基质并快速准确确定过敏原的存在。质谱新技术的发展使得十年前十分复杂的生物样品分析能在十几分钟得以完成，生物大分子研究的需要一直是质谱新技术和新仪器发展的动力之一。作为定性和定量的有力分析工具，质谱技术在过敏原的研究中具有广阔的应用前景。

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