肉及肉制品动物源性成分鉴别技术研究进展

李宗梦，赵良娟，赵宏，曲鹏，郑文杰

（天津出入境检验检疫局，天津300461）

肉及肉制品动物源性成分鉴别技术研究进展

李宗梦，赵良娟，赵宏，曲鹏，郑文杰*

（天津出入境检验检疫局，天津300461）

国内市场近期曝光的多起肉类掺假事件引发了公众对食品安全的担忧。在肉类掺假形式层出不穷的情势下，对动物源性成分鉴别技术的研究逐步成为食品安全领域的研究热点。本文针对肉及肉制品的常见掺假形式以及免疫分析、红外光谱、蛋白质组学及分子生物学检测技术和研究现状进行综述，并对未来技术发展趋势进行了讨论。

肉及肉制品；掺假；动物源性成分

自1987年英国首先发生疯牛病以来，世界各国和地区都先后颁布了法律、法规以控制动物源性成分的使用。我国新颁布的《动物源性饲料产品安全卫生管理办法》中规定禁止在反刍动物饲料中使用动物源性饲料产品（乳及乳制品除外）。2013年初，瑞典、英国等多个欧洲国家卷入“马肉风波”丑闻中，引起各国对肉及肉制品掺假问题的关注。国家质检总局随即发布通报，要求对进口肉类及含肉制品是否掺假进行检测。

对国内市场而言，“掺假”问题一直是消费者投诉的焦点和社会关注的热点。一些不法商贩和企业因利益驱使将猪、鸭等低成本原料掺入牛、羊等高价肉及肉制品中，如原料未经检验检疫，还将涉及到疫病的传播。这些行为不仅侵害消费者利益，还可能因某些宗教食品中含有非清真成分引起纠纷，不利于维护社会安定。如果问题产品出口到国外更会损害我国食品企业的整体形象。基于食品安全性与质量监督的需要以及宗教信仰等问题，有必要对食品中的动物源性成分进行检测。一方面需要制定严格的法律法规来约束生产者和经营者的行为，另一方面需要开发和运用准确、灵敏、简便的检测方法，保障监管的有效执行、为食品质量把关，为打击肉类掺假的违法行为提供技术支撑，维护消费者权益和生命安全，保障食品产业的健康发展。

目前被报道的食品掺假检测技术多达16种左右，其中应用液相色谱法进行食品掺假研究的报道最为常见。其他被广泛报道的检测技术还有红外光谱法、气相色谱法、同位素质谱法、分子生物学技术以及联用质谱技术等[1]。本文对肉及肉制品真伪鉴别常用技术，如免疫分析技术、红外光谱技术、分子生物学技术、以及近年来发展起来的基于蛋白组学的质谱技术的研究现状进行了综述，对未来的技术发展趋势进行了讨论。

1 肉及肉制品常见掺假形式

近来发生的几次重大肉类掺假事件主要涉及用廉价的肉类掺入具有较高经济价值的肉及肉制品中从而达到牟取暴利的目的。这种掺假方式也成为消费者目前普遍关注的食品掺假问题之一。然而，从肉及肉制品的整个生产、加工过程来看，各个环节都有可能出现掺假行为。Ballin[2]等将肉及肉制品的掺假或欺诈问题归为4个类别，即肉的来源、肉成分替代、肉类加工处理过程的改变以及非肉类成分的添加。具体来说，与肉类来源相关的真伪鉴别可细分为对性别、品种、切割方式、饲料摄取、地理溯源、动物年龄、养殖方式（野生还是圈养）的鉴别。与肉成分替代有关的欺诈行为包括掺入或替换为较低价值的肉类或组织、掺入动物性或植物性外源蛋白质或通过掺入廉价动物脂肪以改变原有的脂肪组成。肉类加工过程可能涉及的鉴别内容包括经辐照肉类的检测以及新鲜的和化冻肉类的区分。非肉类成分的添加包括为达到保持肉类新鲜外观而添加的着色剂、防腐剂、香味剂等以及为降低成本、抬高价格而将水注入肉类产品中增加重量的行为。

我国国内市场存在的肉类掺假问题主要集中于低价肉或脂肪掺入牛羊肉等高价肉种。根据掺假方式的恶劣程度可分为3种情况。第一种是用低价值的可食用肉类（如猪肉、鸡肉、鸭肉）掺入牛、羊肉中。此类掺假方式最为常见，其中牛肉掺假主要是熟牛肉制品，因其用香精香料掩盖原有味道，成品在感官上难以辨别。而火锅用羊肉卷则是羊肉掺假的重灾区，不仔细分辨在感官上难以鉴别。第二种是用来源可追溯的非可食用肉类进行掺假。主要涉及的肉类有狐狸肉、貂肉以及马肉等。由于这些肉类大多来源于生产毛皮的养殖场，动物在饲养过程中的用药并无限制，因此食用此类肉产品存在一定的安全隐患。第三种情况是使用来源不明的非可食用肉类进行掺假。此类行为最为恶劣，多见于流动摊贩。常见的掺假肉类有鼠肉、流浪猫、狗肉等。食用此类未经检疫的肉制品存在感染疫病的风险。

2 动物源性成分检测技术

肉及肉制品掺假形式的多种多样决定了每种掺假形式都有其相对应的检测方法。常见的肉及肉制品真伪鉴别技术主要包括基于核酸的分子生物学技术，如PCR、实时定量PCR和分子指纹技术等，基于蛋白质分子结构的免疫分析技术，红外光谱技术以及质谱技术等。应根据所要鉴别的掺假形式选择适合的检测方法，以达到准确、灵敏、特异、快速的检测效果。

2.1 免疫分析技术

基于对物种或组织特异性蛋白标志分子的检测技术被广泛用于肉及肉制品的鉴定，其中最为常见的肉中鉴定技术为免疫分析技术。基于蛋白大分子结构的免疫分析方法具有高灵敏度、高通量、操作简便的特点，可实现对大量样品的快速检测。Macedo-Silva[3]等通过制备抗牛、鸡、猪、马白蛋白的抗血清建立了ELISA方法用于鉴别汉堡中可能掺入的廉价肉类成分，灵敏度可达0.6%。Liu[4]等建立ELISA方法检测猪肉中热稳定肌肉蛋白并对原料和经热处理的肉制品中猪成分进行定量。该方法检测限达到0.5%~0.05%（w/w）。然而，基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析方法对于亲缘关系较近的物种易出现交叉反应。此外，单克隆抗体虽能大大提高检测的特异性，但其制备成本高且费时。蛋白质三级结构在食物加工过程中可能受到破坏而影响抗体识别也是该方法的不足之处。

2.2 红外光谱技术

红外光谱技术主要研究在振动中伴随有偶极矩变化的化合物。通常红外吸收带的波长位置与吸收谱带的强度，反映了分子结构上的特点，可以用来鉴定未知物的结构组成或确定其化学基团；而吸收谱带的吸收强度与分子组成或化学基团的含量有关，可用以进行定量分析和纯度鉴定。红外光谱一般分为近红外（Near Infrared）、中红外（Middle Infrared）和远红外（Far Infrared）3个区域。近年来，红外光谱技术不断发展，在食用油、奶制品、蜂蜜以及肉制品掺假、真伪鉴别方面已有广泛应用并在不断发展中。Cozzolino[5]等运用可见红外光谱和近红外反射光谱法成功鉴别牛肉、羊肉、猪肉和鸡肉。样本经匀质后在400 nm~2 500 nm范围扫描，结合主成分分析（PCA）和虚拟偏最小二乘回归（PLS）模型成功区分以上各肉种，正确率在85%以上。杨志敏[6]等利用近红外光谱技术结合Fisher两类判别法以及多层感知器（multilayer perceptron，MLP）神经网络快速无损鉴别原料肉是否掺假，并建立多种掺假肉的分类识别模型的可行性。其中，近红外结合主成分与Fisher两类判别，建立原料肉与掺假肉的判别函数，以原料肉与注水肉两类样本的平均重心作为区分原料肉与掺假肉的界限。利用近红外结合主成分与MLP神经网络建立原料肉和3种掺假肉的3层神经网络识别模型。该方法总的正确判别率达到90%，模型对预测集52个样本的正确识别率达到94.2%。

现代红外光谱技术由红外光谱设备和化学计量学相结合，已经成为一种方便、快捷、高效的检测技术。该技术将在食品真伪鉴别领域获得更为广泛的应用。

根据塔里木河项目建设进展情况分析，当前，各类节水项目工程建设已完成80%以上，工程节增水量已超过23亿m3，而且，各源流近几年天然来水量接近多年平均值，但是，各源流下泄干流水量不但没有增加，反而都在减少，各源流灌区不仅占用了通过塔里木河项目建设实现的节增水量，还占用了原来的河道下输生态水量。2008年，各源流下泄塔里木河干流的水量比治理前还减少了7.77亿m3，距离规划目标还相差18.1亿m3。干流断流长度在逐年增加，时间在延长，究其原因，主要症结在于管理问题没有得到实质性的解决。

2.3 蛋白质组学在肉及肉制品真伪鉴别中的应用

近年来，基于对肽段及蛋白质分析的质谱技术发展迅速，并被越来越多地用于肉类真伪鉴别研究。由于该方法以物种或成分特异的肽段作为生物标志物进行鉴别，因而具有和DNA分析方法相比拟的识别能力。此外，相比于DNA分析方法，蛋白质组学方法中蛋白质或肽段的提取步骤更为容易，肽段的基础氨基酸序列在加工过程中比DNA更为稳定，使其在处理深加工肉制品和定量测定方面具有不可比拟的优势。

肉及肉制品蛋白质组学常规的研究步骤包括肉类样品蛋白质提取、双向凝胶电泳或等点聚焦分离、胰酶消化以及通过各种质谱方法对肽段进行分析和鉴别。Corzo[7]等在此技术的基础上建立了无需凝胶分离，对肌肉蛋白提取物直接酶解，结合二维液相色谱串联质谱的方法。该方法操作更为简便且更适合于自动化分析。目前已有报道质谱技术可用于对肉类品质的评价，如对屠宰后肉类储存过程中肌肉组织蛋白质组变化进行分析[8]、对肌肉纤维类型组成变化的分析[9]、对肉类腌制过程中蛋白质水解产生的短肽及其风味的研究[10]、过敏原检测[11]、鱼、虾的品种鉴别[12-13]、肉制品中掺入的大豆蛋白及胶原水解物的检测[14]等。在肉类品种鉴定方面，早在1993年Taylor[15]等通过质谱法可检测出牛血红蛋白中混有10%马血红蛋白，但该方法仅限于对纯化后蛋白混合样本的检测而无法检测出混合肉样本中的马成分。Sentandreu[16]等建立了通过肌肉蛋白提取后等点聚焦富集肌球蛋白轻链3，经胰酶消化后进行MALDI-TOFMS和LC-ESI-MS/MS分析的方法，可检测出猪肉中掺入0.5%鸡肉成分。

2.4 分子生物学技术

基于DNA序列特异性的分子生物学技术以动物种属间遗传信息的差异作为肉种鉴别的检测靶点而被广泛使用。相比于蛋白质，DNA由于存在非编码区，因而能够提供更多的遗传信息。此外，DNA热稳定性高，在加工过程中虽然存在一定程度的降解，但仍能提取出小片段DNA用于PCR等分析。同时，DNA具有特异性高、灵敏度高、不受组织类别限制等诸多优势，对于亲缘关系较近的物种具有较高的分辨能力。

近年来，对基于DNA的肉及肉制品真实性鉴别方法的研究越来越多。较早的研究主要运用DNA杂交的方法，而目前则集中于以PCR为基础的各类分析方法，其中包括DNA测序、物种特异性PCR、多重PCR、实时定量PCR、RFLP、RAPD等。此外，具有高通量检测优势的基因芯片技术同样受到研究者的青睐。

2.4.1 基于PCR的核酸扩增技术

PCR技术通过一段特异的寡核苷酸与目标DNA序列结合而在体外合成数以百万计的DNA拷贝。PCR的核心内容是引物和探针的设计，其适用性决定了方法的优劣。通过物种特异性引物对DNA片段进行扩增，通过琼脂糖电泳分离并观察特异性条带是PCR技术鉴别物种成分的最基本方法。但该方法容易造成气溶胶污染，且常用到的溴化乙锭具有高致癌性，不利于实验操作者健康和环境安全。除电泳方法外，还可结合PCR产物测序[17]、单链构象多态性分析[18]、多重PCR[19]等方法对PCR产物进行分析。

线粒体DNA在细胞中拷贝数量大、灵敏度高、进化速度快。此外，其具有较高的种间多样性和较低的种内变异，已被广泛应用于引物设计和靶序列的扩增。常用的线粒体基因有细胞色素b（cytochromeb）基因[20]、12 S和16 S核糖体RNA亚基[21-22]、D-loop区[23]。除了线粒体基因外，细胞核基因由于含有丰富的内含子，也可作为靶基因进行特异性片段的扩增。已报道的细胞核基因有生长激素基因[24]和肌动蛋白基因[25]。

物种特异性PCR是针对不同物种的差异性序列设计引物实现从复杂基质中较为灵敏地将目的片段进行扩增从而达到成分鉴别的目的。该方法无需对产物进行测序或进行限制性片段长度多态性分析（RFLP），尤其适用于经过加工的肉制品。有报道[26]利用物种特异性PCR检测熟香肠中低含量的猪、马、驴成分。该方法向牛、羊肉馅中添加0.0%、0.1%、0.5%、1.0%以及5.0%的马肉、驴肉和猪肉，灵敏度可达到0.1%。Ilhak等[27]通过向牛、绵羊、山羊肉中添加5%、2.5%、1%、0.5%、0.1%的猪、马、猫和狗肉进行物种性PCR扩增得到439、322、274、271、225、212 bp和157 bp的片段。该方法通过增加循环数到35使灵敏度达到了0.1%。

除了上述针对单一物种进行PCR扩增的方法外，还可以对多个物种分别设计特异性引物，在一个PCR反应体系内同时对多个物种的特异性片段进行扩增。该方法成本低、省时、高效，可对多种成分同时鉴别。Tobe等[26]针对猫、狗、狐狸、牛等18种欧洲常见动物的细胞色素b基因分别设计通用引物和特异性引物进行扩增，可对该18种动物进行较好的区分。Matsunaga等[28]针对牛、猪、鸡、绵羊、山羊和马的细胞色素b基因设计通用的上游引物，再通过下游引物加以区分，进行六重PCR扩增得到157、227、274、331、398 bp和439 bp的片段。该方法检测限可达到0.25 ng。

根据实时定量PCR荧光标记方式的不同可分为4种类型：水解探针，如TaqMan探针；发卡探针，如分子信标；荧光共振能量转移（FRET）探针以及嵌入染料。TaqMan探针法中扩增片段小并且只和目的序列结合，具有较高的扩增效率和特异性。但是，该方法对探针设计要求较高。非探针类的SYBRGreen I法则具有简便、经济、直接的优点。该染料与DNA双螺旋的小沟结合后在UV下荧光增强而被探测。虽然该方法特异性不及探针法，但可通过对溶解曲线的判读分析扩增的特异性。Fajardo等[29-30]针对线粒体12 S rRNA和DLoop区设计物种特异性引物，用SYBRGreen法成功鉴别混合肉种的马鹿、欧洲鹿、狍、岩羚羊和比利牛斯山羊。该研究者接下来用TaqMan探针法设计特异引物和探针替代SYBRGreen方法以提高该研究的特异性、灵敏度、扩增效率和准确度。

实时定量PCR在扩增的早期即可以定量，省去了费时费力的测序、酶切、构象分析步骤，直接采集荧光信号省去电泳麻烦，反应快速、可实现高通量，封闭体系避免污染等特点使其相比于普通PCR具有更大优势。目前，我国已颁布的动物源性成分鉴别国家标准和行业标准主要采用的是普通PCR和实时定量PCR技术，并已经形成了成熟的方法体系。

2.4.2 基因芯片技术

近年来，DNA杂交与PCR相结合的基因芯片技术越来越受到关注。该方法操作简便、快速，适合高通量筛查。早在2000年，Radkey等[31]制备了夹心形式的DNA芯片检测STR（short tandeMrepeat）位点。随后，Kemp等[32]在该研究基础上设计不同长度的探针结合未知STR目标序列进而得到STR指纹图谱，并将该方法命名为VLPA（variable-length probe array）技术。在肉成分鉴定方面，基因芯片技术除了高通量的特点外，对于一份未知成分的样品，还可以提供大量信息。进行目前已经有商品化基因芯片可供选择。此类芯片专为肉种高通量筛查而设计，操作简便，快速，结果判读方便。其中德国Chipron公司研发的MeatSpecies 1.6 LCD芯片分析试剂盒针对牛、猪、羊、马等14种动物的线粒体16S rRNA特异性位点进行设计和检测。通过通用引物进行一轮PCR后得到的生物素标记的扩增产物再与固化在芯片上与目的序列互补的寡核苷酸探针进行杂交，经过信号放大步骤可通过直接观察颜色或通过扫描仪扫描结果，用提供的软件进行分析。该方法可检测低于0.5%的动物成分[33]。Cawthorn等[34]用该芯片试剂盒结合物种特异性PCR及DNA测序方法筛查了南非市场销售的139种肉及肉制品，发现68%的样品肉种成分与标签不符。目前，Chipron公司已研发出可同时检测17种家畜和7种家禽的新一代动物成分检测芯片Meat4.0，检测速度进一步提高。此外，德国Greiner Bio-One公司研制的CarnoCheck检测系统可检测猪、牛、绵羊、火鸡、马、鸡、驴和山羊共8种常见畜禽类动物成分。其中猪、牛和马成分检测限为0.05%，绵羊为0.13%，鸡为0.16%，火鸡为0.1%，驴为0.35%，山羊为0.1%，可以满足筛查的需要。

2.4.3 分子指纹技术

分子指纹技术利用基因组多态性特征来区分相近的品种或品系，具有多态性、稳定性高、变异丰富，不受环境条件和个体发育阶段的影响等优点。常见的分子指纹技术包括限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、随机扩增多态性（randoMamplified polymorphic DNA，RAPD）以及扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）等。

PCR-RFLP方法首先需要对目标DNA序列进行扩增，针对特异DNA序列选择限制性内切酶进行切割，通过琼脂糖凝胶电泳分析限制性酶切片段并获得图谱。该方法成本低，易操作，已被广泛应用于动物物种鉴定研究。但由于密码子的简并性以及食品加工过程中DNA的降解，同一物种不同个体可能存在不同的限制片段酶切图谱。因此，应对大样本进行分析，确定其在目标位点是否存在种内多态性。Murugaiah等[35]建立了能够鉴别山羊、猪、鸡、兔等动物成分的RFLP方法。Erwanto等[36]用PCR-RFLP技术结合BseDI限制性酶切对印度尼西亚市场的肉丸中猪成分进行了筛查。Doosti[37]等建立了鉴别牛、羊、猪等6种动物的PCRRFLP技术对伊朗市场的清真食品真实性进行了调查。

随机扩增多态DNA（RandoMAmplified Polymorphic DNA）技术是一种用于检测基因组DNA多态性和基因组遗传标记的方法，目前已被广泛应用于肉成分鉴别。RAPD技术用寡核苷酸单链（一般为10个bp）作为引物，对基因组DNA进行扩增，扩增产物片段的多态性反映了基因组DNA的多态性。Rastogi等[38]以16S rRNA和NADH脱氢酶亚基4以及细胞核肌动蛋白基因建立RAPD-PCR技术鉴别蛇和水牛。该技术的优点是简单、快速，无需专门设计引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸信息。然而，由于PCR扩增产物受到多种因素影响，食品经过加工易导致DNA的破坏等原因使结果不易于重复。

3 结语

肉类掺假现象作为一个全球性的问题将会长期存在，而传统的依靠感官与经验的形态学鉴别手段已远不能满足肉及肉制品掺假问题控制与监管的需要。近年来将生物学、光谱学、仪器分析、化学计量学等相结合发展出的检测技术得到了长足的发展。然而，大部分检测技术仍依赖大型进口仪器，而此类仪器只有在一些规模较大的实验室中配备。因此，开发低成本、易操作、具有较高的灵敏度、准确度的适用于现场快速检测的方法及检测设备有助于肉类制品现场监管，提高实验室的工作效率进而建立和完善从高级实验室到现场快速检测的实验体系，具有重要的实际意义。

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Research Progress in Identification Techniques of Animal Ingredient in Meat and Meat Products

LIZong-meng，ZHAO Liang-juan，ZHAOHong，QUPeng，ZHENGWen-jie*
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Recentexposure ofmeatadulteration incidents in domesticmarkethas raised public concern on food safety issue.In thesituation ofanendlessstreaMofmeatadulteration forms，thestudyof identification techniques ofanimal ingredientsgradually becomeahot topic in the field of food safety.Common formsofmeatadulteration and detecting techniques such as immunological analysis，infrared spectrometry，proteomics and molecular biologyhasbeen reviewed and developmenttrend ofthesemethodshasalsobeen discussed.

meatandmeatproduct；adulteration；animal ingredient

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.032

2014-09-15

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2014IK105）；天津检验检疫科技计划项目（TK086-2013）；天津检验检疫科技计划项目（TK082-2013）

李宗梦（1983—），女（汉），工程师，博士，研究方向：动物源性成分鉴别。

*通信作者：郑文杰（1969—），女，研究员，博士。