浙江洞头不同品系羊栖菜的栽培性状及ISSR分析

徐佳丽，骆其君*，严小军

浙江洞头不同品系羊栖菜的栽培性状及ISSR分析

徐佳丽，骆其君*，严小军

（宁波大学海洋学院，浙江宁波 315211）

浙江洞头栽培的羊栖菜具有不同来源，通过定期测定5种不同品系羊栖菜（原始采集地分别是韩国、浙江洞头、浙江南麂列岛、浙江东极岛及广东汕头）的栽培性状，发现在生长阶段后期，各品系在株重和株高方面都存在显著性差异，原始亲本引自韩国的羊栖菜品系较其他品系具有更好的生长优势，可作为育苗选种目标品系。利用ISSR分子标记技术对这5种羊栖菜品系进行遗传多样性分析，结果显示，从36条引物中筛选出的11条引物，经PCR扩增得到219条羊栖菜DNA片段，其中多态性片段为129条，多态性条带比率达58.9%；5个羊栖菜品系之间的遗传距离为0.151 0～0.382 4，且聚在一起，同属的鼠尾藻在最外群。本研究从DNA分子水平上揭示了目前洞头养殖的羊栖菜品系遗传多态性偏低，为今后开展羊栖菜种质资源保护及其优良苗种的选育提供了一定的理论参考。

羊栖菜；栽培性状；ISSR；遗传多样性

0 引言

羊栖菜（Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.）属于褐藻门，墨角藻目，马尾藻科，马尾藻属，作为一种暖温带-亚热带性的大型褐藻，主要分布于太平洋西北部，在中国北至大连，南至海南岛都有分布，尤其以浙江和福建分布最广。株高一般为30～60 cm，有时长达2 m，藻体可分为假根、茎、叶片、气囊及生殖托。羊栖菜雌、雄异株，以有性及营养2种生殖方式进行繁殖，生活史只有孢子体阶段，无明显的配子体阶段［1-3］。羊栖菜富含蛋白质、多糖、膳食纤维、B族维生素、褐藻酸、甘露醇及人体必需的矿物质和微量元素，具有较高的食用及药用价值，且是优良的海藻工业原料，具有广阔的市场前景［4-5］。自1989年羊栖菜人工试养成功后，现已成为我国浅海藻类栽培的重要种类之一，主要集中在浙江洞头，面积最多时达1 040 hm2，产量近8 737 t，年创汇2 100万美元［6］。

国内学者对羊栖菜进行了大量的研究，ZOU et al［7-8］研究了羊栖菜的繁殖模式及生殖调控；PANG et al［9-10］对羊栖菜也进行了同步受精的研究；张胜帮等［11］进行了羊栖菜多糖的提取分离及其清除自由基的活性研究；刘树兴等［12］通过对羊栖菜干制技术的研究，制成了一种方便营养的干燥即食羊栖菜。YUet al［13］分别利用ISSR及SRAP标记技术对中国沿海9种野生羊栖菜种群作了遗传结构的分析；ZHAO et al［14-15］以羊栖菜种群为对照，用RAPD和ISSR技术研究比较了山东半岛4个不同地区鼠尾藻（Sargassum thunbergii）和海黍子（Sargassum muticum）各自的群体遗传结构；吕慧等［16］运用RAPD技术构建了羊栖菜3个主要养殖品系的DNA指纹图谱。

随着我国羊栖菜栽培在海藻产业中所占比例的日益提高，优良种质的选育仍是未来发展的方向。因此，本实验对栽培于浙江洞头海区5个不同品系来源的羊栖菜测定其栽培性状，并利用ISSR分子标记技术对羊栖菜进行遗传背景的研究，以期为羊栖菜资源的合理开发利用及其遗传育种提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用材料的品系编码、原始采集地及养殖状况如表1所示。将栽培于洞头同一海区5个不同品系的羊栖菜采回，放置于-40℃冰箱中保存，以备后续的DNA提取；用采自浙江洞头的鼠尾藻作种间对照。

1.2 栽培性状的测定

对栽培于洞头海区不同来源的羊栖菜品系，各随机选择其中株高为5 cm左右的藻株20株，自2011年10月25日开始测定，每间隔30 d测定其株重及株高，测定时间至2012年5月。

1.3 基因组DNA的提取

将存放于-40℃冰箱内的6种实验材料分别在无菌海水中复苏过夜。用毛笔在无菌海水中反复轻刷藻体表面后置于质量分数0.7%的碘化钾溶液中浸泡5～10 min，再用无菌海水冲洗数次。用吸水纸吸干表面水分，再各取幼嫩部分藻体约100 mg，立即用液氮迅速研磨成粉。

DNA提取按照Biospin植物基因组DNA提取试剂盒（购自杭州昊天生物技术有限公司）的说明进行。提取后的DNA用核酸蛋白质仪检测其浓度，并用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

1.4 ISSR引物选择

实验所用ISSR引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，共36条，从中筛选出11条扩增产物条带清晰、多态性较好的引物用于不同品系羊栖菜遗传多样性分析。这11条引物的名称、序列及退火温度见表2。

1.5 ISSR-PCR扩增

PCR反应在Biometra PCR仪中进行，2×Power Taq PCR Master Mix购自北京百泰克生物技术有限公司。25μL反应体系中，Mix 12.5μL，dd H2O 8.5 μL，引物（10μmol/L）2μL，模板DNA（DNA含量为0.5～1.5 ng）2μL。

PCR反应条件：94℃预变性5 min；接着设置35个循环：94℃变性45 s，退火1 min（退火温度见表2），72℃延伸2 min；循环结束后72℃延伸10 min。取扩增产物在质量分数为1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，经凝胶成像系统拍照记录结果。

1.6 数据统计与分析

生长性状数据：实验结果以平均值±标准差（x± SD）表示。用IBM SPSS分析软件进行ANOVA分析。

ISSR数据：电泳图谱的每1条带均为1个分子标记，代表1个引物的结合位点。统计条带的有无，强带和可重复性出现的弱带记为1，若无条带则为0。采用NEI et al［17］的计算方法：S=2Nij/（Ni+Nj）来计算样品间的相似性系数（S），其中Nij为材料i和j共有的条带数，Ni和Nj分别为材料i和j各自的条带数。遗传距离D=1-S，利用Popgen 32软件进行统计分析，根据遗传距离用UPGMA法进行聚类分析，构建分子树状图。

2 结果与分析

2.1 栽培性状测定结果

本研究对栽培在浙江洞头同一海区不同的羊栖菜品系分别测定其株重及株高，结果如表3和图1所示。ANOVA分析显示，2011年10月至2012年1月为羊栖菜幼苗的初期生长阶段，各品系之间株重和株高差异不显著。2012年2月至5月是羊栖菜的快速生长期，各品系在株重和株高上存在显著性差异（P＜0.05）。在2012年5月的测定结果中，HG株高值大于DT、NJ和ST，并呈显著性差异（P＜0.05），与DJ差异不显著，DT、NJ和ST之间差异不显著；HG株重值大于DJ、DT和NJ，并呈显著性差异（P＜0.05），与ST差异不大，DJ、DT和NJ之间差异不显著。表明HG品系在栽培实践中，具有良好生产性状的潜力。

表3 不同品系羊栖菜栽培性状比较（n=20，Tab.3 Comparison of cultivated characteristics among 5 strains of Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.（n=20；x±SD）

注：同一行数据上字母相同者表示差异不显著（P＞0.05），不同者表示差异显著（P＜0.05）

HG DT DJ NJ ST 2011.10 0.14（±0.06）a 0.15（±0.06）a 0.15（±0.03）a 0.15（±0.03）a 0.15±（0.04）a 5.2（±0.26）a 5.2（±0.17）a 5.1（±0.26）a 5.1（±0.10）a 5.2±（0.26）日期株重/g 株高/cm HG DT DJ NJ ST a 2011.11 0.18（±0.03）a 0.16（±0.01）a 0.17（±0.04）a 0.16（±0.02）a 0.17±（0.04）a 13.3（±0.79）a 12.5（±1.41）a 12.2（±1.04）a 13.4（±2.61）a 14.4±（1.90）a 2011.12 0.38（±0.04）a 0.32（±0.04）a 0.37（±0.02）a 0.33（±0.02）a 0.39±（0.04）a 18.6（±1.40）a 16.7（±1.95）a 16.6±（2.13）a 17.2（±1.64）a 16.9±（1.65）a 2012.01 0.53（±0.08）a 0.44（±0.05）a 0.47（±0.08）a 0.41（±0.10）a 0.49±（0.09）a 25.9（±2.46）a 23.8（±1.59）a 24.1±（2.00）a 24.4（±1.57）a 23.3±（1.61）a 2012.02 1.68（±0.20）a 1.41（±0.10）a 1.52（±0.16）a 1.39（±0.26）a 1.62±（0.18）a 33.9（±1.15）a 27.6（±2.05）c 32.6±（1.08）a 31.7（±1.57）ab 28.5±（3.66）bc 2012.03 3.67（±0.34）a 3.09（±0.17）b 3.49（±0.33）ab 3.14（±0.17）ab 3.51±（0.33）ab 50.5（±2.18）a 41.4（±2.16）b 49.5±（3.48）a 44.5（±2.00）b 49.5±（2.29）a 2012.04 6.86（±0.84）a 5.82（±0.17）c 6.12（±1.13）a 5.61（±0.46）bc 6.55±（0.69）a 98.5（±1.50）a 88.8（±3.06）b 86.7±（2.19）bc 84.7（±2.56）bc 82.7±（1.21）c 2012.05 17.9（±1.15）a 13.7（±1.95）c 14.9（±1.21）bc 13.3（±1.70）c 16.4±（0.60）ab 169.8（±2.98）a 157.3（±2.51）b 164.3±（4.19）a 152.3（±2.16）bc150.3±（3.74）c

2.2 PCR扩增结果

在ISSR-PCR扩增实验中，以提取的5个不同品系的基因组DNA为模板进行引物筛选，结果从36条引物中筛选出11条引物，可扩增出清晰稳定，重复性好，多态性高的条带（部分引物的扩增结果见图2）。扩增结果显示不同引物在所有材料中的扩增条带总数不同，扩增片段大小在250～2 250 bp之间，11条引物在5个羊栖菜样品中共扩增出219条DNA带，其中多态性条带为129条，占58.9%。

2.3 遗传多样性分析

利用Popgen 32软件计算不同样品间的遗传距离（表4）。由表4可知，5个羊栖菜品系之间的遗传距离在0.151 0至0.382 4之间；其中DT与ST之间的遗传距离最大，为0.382 4；DT与NJ之间的遗传距离最小，为0.151 0。根据个体间的遗传距离，结合UPGMA法构建聚类分析图（图3）可知，5个羊栖菜品系首先聚在一起，DT首先与NJ聚为一类后与HG聚在一起，再与DJ聚合，最后才与ST聚合，同属的鼠尾藻在最外群。

3 讨论

3.1 不同品系羊栖菜的栽培性状

近年来，随着市场对羊栖菜需求的日益增长，羊栖菜资源的开发利用受到众多养殖户的追捧。不仅广泛应用于食品、医药领域，亦是海藻工业的重要原料之一，可用于褐藻胶、甘露醇、碘及褐藻淀粉等物质的提取。本研究对栽培于洞头同一海区不同品系的羊栖菜定期测定其生长性状，通过相互比较，发现在生长阶段后期，不同品系羊栖菜在株重和株高方面存在显著性差异（P＜0.05），HG品系较其他品系具有更好的生长优势，可为苗种选育提供目标品系，这对于羊栖菜总产量的提高具有重大意义。

3.2 不同品系羊栖菜的遗传多样性

分子标记技术可以从分子水平上区分不同品种之间的差异，而不受环境条件的限制及组织发育的影响，稳定可靠［18］。本文利用ISSR分子标记技术，筛选出的11条引物在5个品系的羊栖菜中共扩增出219条DNA带，其中多态性条带为129条，多态性比率为58.9%。由聚类图可知，DT首先与NJ聚为一支，两者间遗传距离最小，为0.151 0，亲缘关系最近，这2种品系原始亲本均位于温州，地理位置相近，洞头本地栽培羊栖菜（DT）的亲本最初可能来自南麂岛野生羊栖菜（NJ）。HG与DT之间的遗传距离为0.173 0，HG品系的原种自韩国引进，这2个品系原种虽地理位置相隔甚远，但均栽培于洞头同一海区，养殖环境相似，且HG品系引进栽培时间较其它品系早，在不断的养殖期间加强了两者群体间的基因流动，故而遗传距离较小。

于深辉［19］对我国沿海9个地理种群的羊栖菜野生种群作了ISSR遗传结构分析，得到99.61%的高遗传多态性；2008年，吕慧［20］利用ISSR遗传标记方法对浙江洞头养殖常用的羊栖菜品系进行了遗传多态性分析，结果显示多态位点比率为67.4%；本文运用ISSR对洞头栽培的不同羊栖菜品系进行分析得到其多态性比率为58.9%，多样性程度明显降低。分析原因认为：一方面，野生羊栖菜来源于我国沿海9个不同的地理种群，地理隔离较大，生殖隔离较好，故种群之间基因流动水平较低，遗传变异很高。另一方面，2008年前，羊栖菜的人工养殖主要依靠营养繁殖，即采取海礁上自然生长的野生苗种作为种质来源。随后，羊栖菜人工养殖采用假根渡夏、幼孢子体的“北育南养”等方式，亲本来源于之前养殖的野生苗种，野生种经历几代人工育苗、栽培之后，存在基因单一化流动态势，遗传变异必然有所降低，多样性程度也随之降低。对于目前洞头栽培品系遗传多态性较低的问题，可充分利用我国沿海丰富的野生羊栖菜资源，为日后推进羊栖菜的种苗选育提供优质的亲本来源。

4 结论

（1）通过定期测定浙江洞头不同栽培品系羊栖菜的生长性状，发现在生长阶段后期，各品系的株重和株高都存在显著性差异（P＜0.05），原始亲本引自韩国的羊栖菜品系较其他品系具有更好的生长优势，可作为育苗选种目标品系。

（2）应用ISSR技术分析发现洞头羊栖菜养殖品系遗传多样性程度偏低，而我国沿海丰富的野生羊栖菜资源并未得到充分的研究利用，积极开展羊栖菜种质资源的保护及优良苗种的选育是羊栖菜产业发展的关键环节。建立羊栖菜优良的种质基因库，丰富其遗传背景，可为今后羊栖菜全人工养殖模式的开展提供充分且优异的亲本材料，以促进羊栖菜产业的可持续发展。

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Analysis of cultivated characteristics and ISSR of different strains of Sargassum fusiforme（Harv.）Setch. in Dongtou，Zhejiang

XU Jia-li，LUO Qi-jun*，YAN Xiao-jun
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

There are diverse origins of cultivated Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.in Dongtou，Zhejiang Province.In this paper，5 strains of S.fusiforme were investigated，of which one came from Korea，three were collected from Dongtou，Nanji Island，Dongji Island of Zhejiang Province，and the last one was from Shantou，Guangdong Province.Significant differences were found among the five strains in the algal weight and height.The strain of S.fusiforme from Korea had better growth advantages than others，so it could be used as target strain for breeding.The genetic diversity of S.fusiforme was analyzed by ISSR makers.The genetic distances among the samples were calculated by Popgen 32 and the cluster analysis was performed by UPGMA method.The results showed that 11 ISSR primers could amplify polymorphic and informative bands from the 36 screened primers.Total 219 DNA bands were amplified，of which 129 were polymorphic and the percentage of polymorphic loci reached to 58.9%.The genetic distances of the 5 samples varied from 0.151 0 to 0.382 4.In the dendrogram，five strains of S.fusiforme clustered into one clade and S.thunbergii were in the outgroup.The study revealed that the genetic diversity of the cultivated S.fusiforme in Dongtou was low on the DNA molecular level，which provided theoretical reference for the developing genetic resources conservation and superior seed breeding of S.fusiforme in the future.

Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.；cultivated characteristics；ISSR；genetic diversity

S968.42+5；Q755

A

1001-909X（2014）02-0074-06

10.3969/j.issn.1001-909X.2014.02.010

徐佳丽，骆其君，严小军.浙江洞头不同品系羊栖菜的栽培性状及ISSR分析［J］.海洋学研究，2014，32（2）：74-79，

10.3969/j. issn.1001-909X.2014.02.010.

XU Jia-li，LUO Qi-jun，YAN Xiao-jun.Analysis of cultivated characteristics and ISSR of different strains of Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.in Dongtou，Zhejiang［J］.Journal of Marine Sciences，2014，32（2）：74-79，doi：10.3969/j.issn.1001-909X. 2014.02.010.

2013-06-27…………

2014-03-31

国家科技支撑计划课题资助（2011BAD13B08）；国家海洋公益性行业科研专项经费项目资助（201105009）；浙江省海洋环保项目资助（WZHX2012-10-116）

徐佳丽（1989-），女，浙江新昌县人，主要从事藻类分子生物学与遗传育种方面的研究。E-mail：xujiali1009@163.com

*通讯作者：骆其君，副教授，E-mail：luoqijun@nbu.edu.cn