基于正交实验的高含量藻红蛋白紫菜丝状藻体优化调控培养条件研究

林汝榕，邢炳鹏，柯秀蓉，蔡文旋，林锡煌，张稚兰

基于正交实验的高含量藻红蛋白紫菜丝状藻体优化调控培养条件研究

林汝榕1，2，邢炳鹏1，2，柯秀蓉1，2，蔡文旋1，2，林锡煌1，2，张稚兰1，2

（1.国家海洋局海洋大气化学与全球变化重点实验室，福建厦门 361005；2.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门 361005）

丝状藻体在紫菜养殖的人工苗种生产中非常重要，在利用于分离提取高价值的藻红蛋白方面也具有潜在的利用价值。本研究采集了成熟紫菜叶状体的果孢子释放的初始丝状藻体，基于3因子3水平的正交实验设计方案［采用具有分析交互作用的正交表L27（313）］，确定了丝状藻体藻红蛋白含量对环境因子的响应以及优化的调控培养条件。结果表明，温度、光照强度和盐度因子对丝状藻体藻红蛋白含量均有显著影响（P≤0.048 1），并且温度和光照强度或盐度因子间存在交互作用（P≤0.043 1），但光照强度和盐度因子间的交互作用不显著（P=0.469 8）。获得的优化调控培养条件为：温度18℃、光强1 500 lx、盐度20或25。优化调控培养条件下的丝状藻体藻红蛋白含量高达64.73 mg/g.dw（平均值±标准偏差SD为58.24±5.07 mg/g.dw）。

坛紫菜；丝状藻体；藻红蛋白；正交实验；温度；光强；盐度

0 引言

栖息于海洋环境的海洋藻类含有许多各种不同生物活性的天然产物，因此海洋藻类的开发利用长期以来都受到国内外研究者的普遍关注［1-5］。藻红蛋白（phycoerythrin）是存在于某些海洋红藻藻体中的一种重要藻胆蛋白，具有清除体内有害自由基、提高机体免疫力、抗氧化、抗辐射、抗衰老及抗肿瘤等方面的生物活性功能［6-10］。藻红蛋白在红藻藻体中除了作为与光合作用功能密切相关的重要辅助采光色素外，由于藻红蛋白独特的分子结构，具有荧光发射性强、摩尔消光系数大、荧光量子产率高、斯托克位移大、荧光位于近红光区、背景光干扰小、不易淬灭等特点，因此可作为性能优异的荧光标记物，在生物细胞分析、药物分子体内的转移代谢、疾病诊断与预防等方面具有广泛的应用潜力［11-17］。

能否高效获取藻红蛋白主要取决于如下几个方面：用于分离提取藻红蛋白所需的藻材料是否容易得到；藻材料藻红蛋白含量的高低；涉及分离提取方法步骤的难易程度；藻材料中存在的干扰分离纯化成分量的多少等。其中采用人工调控培养技术获得高含量藻红蛋白藻体是解决高效制备藻红蛋白的重要途径。紫菜丝状藻体不仅是紫菜养殖中人工育苗的重要藻材料，也具有开发利用于分离提取藻红蛋白的潜在应用价值。本研究通过具有交互作用分析的3因子（温度、光强和盐度）及3水平的正交实验，探讨了调控培养条件下，坛紫菜丝状藻体藻红蛋白含量对环境因子的响应和优化调控培养条件，为寻求培养生长状况良好、藻红蛋白含量高的丝状藻体优化培养条件方法提供参考。

1 材料和方法

1.1 用于优化培养条件实验的丝状藻体的获取

于紫菜收成季节从莆田秀屿紫菜养殖场采收成熟的紫菜叶状体。用镊子夹纱布，蘸灭菌海水小心清洗叶状体表面，然后用灭菌海水淋洗3～5遍，置于15℃环境阴干4～10 h。用灭菌剪刀剪下叶状体的成熟部位，放于装有灭菌海水的1 000 m L的烧杯中。10～24 h后，取出叶状体。在已有果孢子释放的烧杯中加入灭菌过的f/2营养液，于盐度20，温度20℃，光照强度1 600 lx，光照周期（L∶D=16∶8）的培养箱中培养，直至培养长出具有簇状棕红色的丝状体藻丝。

1.2 优化调控培养条件实验设计及测定方法

1.2.1 实验研究考察的因子和水平

影响坛紫菜丝状藻体藻红蛋白含量的因子水平设置见表1。

1.2.2 丝状藻体的调控培养

由果孢子萌发长成的丝状藻体材料按正交实验方案［采用具有分析交互作用的正交表L27（313）］设置的相关条件进行调控培养，每组初始实验时的丝状藻体重量为10 mg。3因子（温度、光强和盐度）均设置3个水平（分别用1，2，3代码表示）。设置的其他附带固定培养条件为：p H 8.5、复合维生素质量浓度15μg/L、Na HCO3浓度质量2 mg/L、每天光照时数18 h、营养液浓度f/2。调控培养30 d后，测定丝状藻体的藻红蛋白含量。

1.2.3 藻红蛋白的萃取及含量的计算

培养30 d后，用筛绢过滤培养的丝状藻体，以控去水分，并用滤纸进一步吸干水分，放入研钵研磨成浆状，加入0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液置于暗处4℃萃取20 h。样品液用离心机10 000 r/min离心30 min，取上层藻红蛋白萃取液，用分光光度计测定其在564，618和730 nm波长的吸光值，同时测定用滤纸吸去水分的丝状体藻丝的质量以及置于80℃干燥12 h后的藻体干质量，确定出湿藻体和干藻体质量比值，最后按SAMPATH-WILEY et al［18］的方法计算丝状藻体的藻红蛋白含量，表达为：毫克藻红蛋白/克干重藻体（mg/g.dw）。

1.2.4 实验结果的分析处理

根据3因子3水平的正交实验设计，设置调控培养条件实验，同时运用方差显著性检验和分析的方法，考察3个因子（温度、光强和盐度）对丝状藻体藻红蛋白含量的影响，分析这些关键性因子的主次顺序及交互作用、确定优化的调控培养条件下因子水平的最佳搭配。

1.3 实验试剂及仪器

实验所用硝酸钠、磷酸二氢钠、硫酸锌、硫酸铜、氯化锰、柠檬酸铁、钼酸钠、乙二铵四乙酸钠、六水氯化钴、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸均为AR试剂，购自厦门绿茵试剂有限公司。复合维生素片为杭州民生药业集团有限公司所生产。

实验所用仪器包括：AL204电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），PGX-450C智能光照培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂），WY035Y手持式盐度计（宁波市丰名仪器有限公司），ZDS-10照度计（上海嘉定学联仪表厂），哈纳HI98108手持式酸度计（上海树信仪器仪表有限公司），Neofuge15R台式高速离心机（香港力康发展有限公司）以及UV-2600紫外可见光分光光度计（北京瑞利仪器有限公司）。

1.4 数据分析处理

采用SPSS 15.0软件分析处理实验数据。

1.5 优化调控培养条件的验证

采用正交实验获得的优化调控培养条件，实施进一步的培养效果验证。实施例证序号1～3的培养条件为温度18℃，光强1 500 lx，盐度20；实施例证序号4～5的培养条件为温度18℃，光强1 500 lx，盐度25。

2 结果与分析

2.1 优化调控培养条件的正交实验结果与分析

坛紫菜丝状藻体藻红蛋白含量的正交实验结果及分析见表2。在不同的调控培养条件下，丝状藻体藻红蛋白含量表现出明显的差异，其数值的变动范围介于15.28～61.50 mg/g.dw之间。即表明不同的调控培养条件对丝状藻体藻红蛋白含量有相当大的影响，数值大小相差最大可达4倍左右。因此，欲获得具有高含量藻红蛋白的丝状藻体，调控培养条件十分重要。表2中正交实验研究分析计算的极差值R的大小反映了相应因子作用或因子之间交互作用对指标值影响能力的大小，极差值大的因子，意味着其不同水平对指标量所造成的差别较大，通常是主要因子；极差值小的因子，意味着其不同水平对指标量所造成的差别较小，一般是次要因子。

本研究结果表明，温度、光照强度和盐度所造成的极差值R分别为169.66，126.23和50.53。因此，按极差值大小，影响丝状藻体藻红蛋白含量的因子的主次顺序依次可排列为：温度＞光照强度＞盐度。从不同因素之间产生的交互作用影响的大小来看，温度和光照强度产生的交互作用（A×B）所造成的极差值R为95.12，温度和盐度产生的交互作用（A×C）所造成的极差值R为96.58，光照强度和盐度产生的交互作用（B×C）所造成的极差值R为45.74，因此，对于丝状藻体的藻红蛋白含量，因子间的不同组合所造成的交互作用的影响大小顺序依次可排列为：A× C＞A×B＞B×C。若综合考察主因素和因素间的交互作用对丝状藻体藻红蛋白含量的效应（极差值R的大小），影响丝状藻体藻红蛋白含量的大小顺序依次可排列为：A＞B＞A×C＞A×B＞C＞B×C。

2.2 正交实验结果的方差分析及两因子间的交互作用分析

坛紫菜丝状藻体藻红蛋白含量正交实验结果的方差分析见表3。调控培养条件下丝状藻体藻红蛋白含量的方差显著性检验和分析的结果进一步清楚表明，所考察的3个环境因子均能显著影响到丝状藻体的藻红蛋白含量。温度对丝状藻体藻红蛋白含量大小具有最显著的影响（P=3.564×10-5），其次是光照强度对丝状藻体藻红蛋白含量大小也有极显著的影响（P=2.261×10-4），海水盐度的影响也是显著的（P=4.813×10-2）。分析结果还表明，温度因子与光照强度或海水盐度间的交互作用是显著的（P分别为3.833×10-2和4.314×10-2），但光照强度与海水盐度间不存在交互作用（P=0.469 8）。

方差分析结果表明了因子之间存在交互作用，即各因子水平之间存在交互效应，因而考察丝状藻体的藻红蛋白含量对应的各个因子间的交互作用情况、确定各个因子水平如何合理搭配，对于高含量藻红蛋白丝状藻体培养获得是很重要的。由丝状藻体藻红蛋白含量两因子间交互作用的分析结果（表4）可看出：温度因子A和光照强度因子B的最佳搭配为A2B2（最大的搭配指标值是53.02）；温度因子A和盐度因子C的最佳搭配是A2C1，2（最大的搭配指标值为45.30和45.32，十分接近）；而光照强度因子B与盐度因子C的最佳搭配是B2C2（此时最大的搭配指标值为39.94）。因而，从有利丝状藻体藻红蛋白高含量指标参数综合考虑，最适宜的环境条件参数因子数值的搭配应为A2B2C1，2，在这种优化调控培养条件下培养的丝状藻体可获得最高含量的藻红蛋白。

2.3 优化调控培养条件的验证

采用正交实验获得的优化调控培养条件，实施进一步的培养效果验证，实施例证序号1～3的培养条件为温度18℃，光强1 500 lx，盐度20；实施例证序号4～5的培养条件为温度18℃，光强1 500 lx，盐度25。获得的丝状藻体藻红蛋白含量结果见表5。由进一步具体实施例证的结果可看出：采用获得的优化条件，调控培养的丝状藻体藻红蛋白含量高，指标参数值变动范围介于53.28～64.73 mg/g.dw（平均值±SD为58.24±5.07 mg/g.dw），说明本实验研究得出的优化调控培养条件能促进提高丝状藻体的藻红蛋白含量，而且效果比较稳定。因而，采用优化的调控培养条件，可以达到丝状藻体藻红蛋白含量高的良好效果，培养的丝状藻体适宜作为分离提取制备藻红蛋白的理想藻材料。

3 讨论

正交实验设计是研究多因子多水平效应的常用实验方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的实验点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，因而能达到高效、快速、经济的实验效果，该方法在目标物的制备生产、工艺参数条件优化等方面都有广泛的应用［19-24］。本研究采用适宜的多因素多水平的正交试验，通过对实验结果的极差分析、方差分析以及不同因子水平的效果评价，确立了促进坛紫菜丝状藻体达到高含量藻红蛋白的优化调控培养条件，获得了良好的效果，丝状藻体藻红蛋白含量最高达到64.73 mg/g.dw（平均值± SD为58.24±5.07 mg/g.dw）。通过设计适宜的正交实验方法，考察紫菜丝状藻体藻红蛋白含量对多因子水平环境条件的响应变化，确定出优化的调控培养条件，从而提供丝状藻体适宜的环境条件，达到藻红蛋白含量高的效果，这对于藻类材料高效开发利用具有重要的应用价值。

目前，国内外尚无有关紫菜丝状藻体藻红蛋白含量的分析报道。一些研究者做了其他藻材料的藻红蛋白含量的分析测定。徐燕等［25］的分析结果表明，坛紫菜绿色叶状体藻红蛋白含量低，仅为5.513 0± 1.049 6 mg/g.dw；陈昌生等［26］对坛紫菜人工杂交和选育的5个品系中藻红蛋白含量为32.54～61.55 mg/g.dw；纪德华等［27］比较了福建沿海8个野生坛紫菜种群的藻胆蛋白含量，结果表明藻红蛋白含量为19.56～29.49 mg/g.dw。有贺祐胜等［28］指出条斑紫菜藻红蛋白含量占藻体干重的2.4%～3.5%；孙利芹等［29］研究了培养条件对紫球藻藻红蛋白含量的影响，发现高光照有利于藻红蛋白的积累，并且随着光照强度的增加，藻体细胞藻红蛋白的含量随之增加，N营养盐较高时，有利藻红蛋白的积累，获得的藻红蛋白含量可达藻干重的5.3%～9.14%；李信书等［30］也发现，增加培养液中的N和P含量可以显著提高条斑紫菜的藻红蛋白的含量，藻红蛋白含量为1.5～4.5 mg/g.dw；孟庆俊等［31］考察了营养盐可得性对坛紫菜及藻红蛋白含量的影响，藻红蛋白含量为0.30～0.33 mg/g.fw；蒋雯雯等［32］研究了营养盐浓度变化对2种菊花江蓠藻红蛋白含量的影响，结果含量为2.0～7.5 mg/g.dw；ZHANG et al［33］分析了来自江苏黄海不同地点3种品系的条斑紫菜的藻红蛋白含量为5～7.5 mg/g.fw，并指出藻红蛋白含量除与品系有关外，还与海区的温度和光照有关。为了有利于藻红蛋白分离提取的高效化，藻材料藻红蛋白含量的大小至关重要。海洋藻类生物由于长久的进化历程以及对环境的长期适应性，不同的藻类对各种环境因子具有特殊的需求，因而应针对不同的藻类，提供适宜的培养条件，才能有利藻生物累积更高含量的藻红蛋白。与已报道的文献相比较，本研究通过优化调控培养的方法获得的丝状藻体具有更高的藻红蛋白含量，体现了调控培养丝状藻体在作为分离提取藻红蛋白藻材料上具有明显优势。另外，需要提及的是：在本文的调控培养实验中所涉及的其他附带固定培养条件，例如：海水p H值、添加复合维生素和Na HCO3、每天光照时数，提供充足的f/2营养盐介质，可能在一定程度上更有利于丝状藻体藻红蛋白成分的累积，达到良好的优化调控培养效果.

从海洋藻类中获取高价值的天然活性产物是当前海藻开发利用的热点［1，4-5，34］，本研究表明，采用优化调控培养方法可获得高含量藻红蛋白的丝状藻体，该方法操作简便易行，效果明显，获得的丝状藻体除了具有藻红蛋白含量高的特点外，还具有其他方面的优点，例如，由于是采用人工优化调控培养紫菜丝状藻体，因而无需到现场海区获取藻材料，有利保护自然海区的生态环境；而且藻材料的获得可得到较可靠的保证，不受季节、时间等限制性条件的影响。此外，采用优化调控培养的丝状藻体具有细胞壁薄、藻红蛋白含量高、干扰性物质少、可形成藻丝絮团、采收方便等特点，对于进一步分离提取制备高纯度藻红蛋白目标物十分有利，达到藻类材料高值化利用的目的，可为分离提取高纯度藻红蛋白提供良好的藻材料。

4 小结

丝状藻体作为一种重要的藻材料，为了达到良好的培养效果，优化调控培养技术至关重要。本研究考察了3个与紫菜丝状藻体藻红蛋白含量密切相关的外界条件因子，采用了适宜的多因子多水平的正交实验，同时进行了相关的显著性分析和验证实验，从而获得具有显著提高丝状藻体藻红蛋白含量的优化调控培养条件是温度18℃、光强1 500 lx、盐度20或25。采用优化的调控培养条件，有利于分离提取藻材料中含有的高价值天然活性产物，从而有望达到更显著的经济效益。

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Optimal culture conditions for Porphyra haitanensis conchocelis with high content of phycoerythrin based on the orthogonal experimentation

LIN Ru-rong1，2，XING Bing-peng1，2，KE Xiu-rong1，2，CAI Wen-xuan1，2，LIN Xi-huang1，2，ZHANG Zhi-lan1，2
（1.Key Laboratory of Global Change and Marine-Atmospheric Chemistry，Xiamen 361005，China：2.Third Institute of Oceanography，SOA，Xiamen 361005，China）

The conchocelis is very important for artificial seeding production in Porphyra cultivation and can be potentially used for separation and extraction of high value phycoerythrin.We investigated several influential factors related to phycoerythrin content of Porphyra haitanensis conchocelis and studied the optimal controlled culture conditions under which high content of phycoerythrin was obtained.Specific operational processes：initial conchocelis was obtained from carpospores release of mature Porphyra thallus and responses of conchocelis phycoerythrin content to environmental factors and optimal controlled culture conditions were determined based on the designation of an orthogonal experimentation with interactional analysis of three factors and three levels［L27（313）］.Results demonstrate that factors of temperature，light intensity and salinity have significant effects on phycoerythrin content（P≤0.048 1）.There are factorial interaction occurrences between temperature and light intensity or salinity（P≤0.043 1）.However there is no significant interaction between light intensity and salinity（P=0.469 8）.The optimal controlled culture conditions for high content of phycoerythrin are：temperature 18℃、light intensity 1 500 lx and salinity 20 or 25.Under optimal controlled culture condition，conchocelis phycoerythrin content is as high as 64.73 mg/g.dw（average±SD：58.24±5.07 mg/g.dw）.

Porphyra haitanensis；conchocelis；phycoerythrin；orthogonal experimentation；temperature；light intensity；salinity

S968.43+1；Q946.1

A

1001-909X（2014）02-0067-07

10.3969/j.issn.1001-909X.2014.02.009

林汝榕，邢炳鹏，柯秀蓉，等.基于正交实验的高含量藻红蛋白紫菜丝状藻体优化调控培养条件研究［J］.海洋学研究，2014，32（2）：67-73，

10.3969/j.issn.1001-909X.2014.02.009.

LIN Ru-rong，XING Bing-peng，KE Xiu-rong，et al.Optimal culture conditions for Porphyra haitanensis conchocelis with high content of phycoerythrin based on the orthogonal experimentation［J］.Journal of Marine Sciences，2014，32（2）：67-73，doi：10. 3969/j.issn.1001-909X.2014.02.009.

2014-02-19…………

2014-03-10

厦门市海洋生物技术产业化中试研发基地建设平台项目资助（3502Z20111001-5）

林汝榕（1956-），男，福建龙岩市人，研究员，博士，主要从事海洋藻类资源开发与利用方面的研究。E-mail：linrulong2010@163.com