分子生物学技术在临床兽医学上的研究与应用

肖延光 郝占忠 魏雅茹 王素红 赵爱民 （山东省聊城市畜牧站 252000）

近年来,生物技术不断向深度和广度迅猛发展，其发展与动物疫病的诊断、预防和治疗技术之间已并无明显的界限，并且起了不可替代的作用;如转基因动物既能用于抗病育种，也能用于生产疫苗和药品;核酸疫苗具有预防和治疗的双重作用;单克隆抗体不但用于免疫诊断，也可用于被动免疫和导向药物治疗等。生物技术已经不是一项单一的技术，而是一个综合的技术体系，尤其是在兽医临床上的应用、发展中，需要多种不同技术、学科和领域的相互渗透、相互配合。

1 核酸的分子杂交

基因探针技术是临床应用最早的分子生物学技术，至今仍常盛不衰，它不仅用于微生物等基因鉴定方面，而且在印迹技术如(southern blot)方面以及新近成为热门的基因芯片技术方面都有广泛应用，不少探针已商品化。

2 PCR技术

PCR技术是一种体外模仿体内DNA复制(扩增)过程的技术。可以在短时间内大量复制出原来很少的DNA。其作为一种新的疾病检测手段，具有灵敏、特异、简便、快速等优点，可以从一根毛发、一滴血、一个细胞中扩增出足量的DNA供分析诊断;PCR技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等的诊断。但该技术大多为定性分析，结果重复性差、可靠性低。因而，给临床诊断带来混乱。近年来常规PCR技术用于诊断、鉴定、科研、制备探针和进一步结合基因工程进行产品开发等，是一项极其有效、非常实用的技术，随着分子生物技术的发展已衍生出许多新方法新技术，如:定量PCR技术、荧光PCR技术、巢式PCR、不对等PCR等。（1）定量PCR技术:定量PCR技术巧妙利用了PCR技术的DNA高级扩增、探针技术特异性和光谱技术的敏感性及定量分析的优点。克服了常规PCR定性检测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性。（2）荧光PCR技术:对比常规PCR技术，其是一种良好的检测HBV-DNA的方法。试验特异性强、重复性好(批内、批间变异系数均<5%)，检出阳性率和敏感性高。试验条件标准化后，将有良好的临床应用价值。

3 DNA(基因)酶切图谱分析

（1）DNA(基因)酶切图谱分析即用特定的限制性酶消化(水解切断)DNA长链后，可以得到核酸的片段。由于不同的DNA碱基序列不同，用识别某一特定碱基序列的限制酶进行酶切时，所得到的DNA链片段的长短也不一样(Makimura等，2002)。片段的长短可用凝胶电泳进行分离后，与一系列已知分子量(或碱基对，bp)的标准参照物(或称标志物，marker)进行比较，大体计算出各片段的分子量或碱基数。这一方法已广泛应用于临床基因诊断。例如，当一个基因发生点突变后引起某一限制酶识别点改变，就可以用本法检测出来。（2）临床和科研中已沿用多年的DNA限制性片段长度多态性分析(RFLP )，就是本法具体应用的典型例子(Yu等，2002)。在畜群中，各个体基因的核苷酸序列会存在一定差异，称为基因多态性。基因多态性位点普遍存在于动物的基因组中，某一致病基因与特定的多态性片段紧密连锁，就可以用这一多态性片段作为一种“遗传标记”来判断畜群或幼畜是否携带有致病基因。目前认为基因多态性是个体的“身份证”;有的虽然不表现疾病，但也许会影响对药物的反应和用药效果，因而有人提出将来会出现按个体基因型选择用药的种类和剂量的所谓“个体化”用药。

4 单链构象多态性(SSCP)分析

单链构象多态性是一种简单、有效、快捷、廉价的检测非常少量的基因组DNA或cDNA突变的技术。其原理及技术要点是:由于单一碱基的替代(改变)，引起DNA链构象改变(Calegari等，2002)。后者可导致DNA在非变性凝胶电泳中出现迁移率的改变。因此，首先用PCR技术扩增所检验的模板，然后进行变性、电泳、显示，根据显示的条带与标准参照物对比，即可判断所测DNA链是否有变异。

5 DNA序列测定

上述方法仅能大致了解某一核苷酸链片段是否存在变异，并不能确定哪一位点核苷酸发生变异和何种核苷酸取代了何种核苷酸，这就要求进行基因测序。关于DNA测序的方法，因其十分复杂，一般临床实验室无法进行。有必要时可委托有条件的公司或研究机构进行，本文从略。由近几年世界范围进行的人类基因组计划(其主要步骤是基因测序)可知，当今基因测序是一项大规模工程，可以自动化进行。

6 DNA微阵列(DNA microarray)技术

DNA微阵列技术又称蛋白质微阵列技术、生物芯片(biochip)技术，其是当前分子生物学领域最热门的技术，国内外在竞相开发，微阵列技术的大致步骤是:在一小片固相基质(如修饰过的玻璃或尼龙膜片)上，高密度地点上成千上万个DNA片段，制成微阵列，即DNA或生物芯片。检测时采用分子杂交手段，将荧光标记的标本与微阵列进行杂交，杂交完成并洗涤后，用激光共聚焦显微扫描仪检测荧光信号，通过微机处理分析，即可获得检测结果(Ja-cobs等，2003)。目前国内外已制出多种生物芯片商品，其实际应用亦已逐步展开。据文献报道，微阵列技术应用范围极广如致病微生物的检出、癌基因及抑癌基因、组织配型、基因表达的研究、基因功能分析、基因制图、基因突变和多态性的检测等，是一项非常有发展前景，适合临床检验应用的先进技术。

7 荧光原位杂交染色体分析(FISH)

荧光原位杂交染色体分析是一种在染色体上进行基因定位的技术，其基本原理和步骤是:在已知某靶基因核苷酸序列的前提下，先合成与靶基因互补的经荧光标记的DNA探针，与常规方法制备的中期染色体进行原位杂交。在荧光显微镜下可以观察到该靶基因所在的染色体(臂、区、带、亚带)(Home等，2002)。其是一项非常有用的技术，它不仅可用于基因在染色体上定位的研究，而且可直接用于实验室诊断。例如，慢性髓系白血病患者的9号与22号染色体的长臂相互易位所形成的Ph染色体，形成了一个融合基因—bcrabl(并编码表达一种叫P120BCR/ABL的蛋白质)，这是该病发病的重要因素。早先用染色体分析鉴定这种染色体变异，准确性差，阳性率也不高(Blasberg，2002)。改用bcrabl基因探针进行原位杂交很容易鉴定，并且不一定需要分裂中期的染色体，在核内处于间期的染色体也可检出。目前在各类白血病中，已鉴定出好几种类似的融合基因(Chatziioannou，2002)。为此，当前对白血病的实验室诊断，已由过去的M(形态学)I(免疫学，即细胞表面分化抗原CD )C(细胞化学染色)改为MICM，后一M即指分子生物学。FISH在基因定位研究和诊断中的应用还很多。

8 单抗阻断ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清型特异性抗体

苗得园等在副鸡嗜血杆菌A，C型特异性单克隆抗体的基础上成功建立了能区分A，C血清型抗体的阻断ELISA诊断方法(Maclean等，2003)。并应用此法对9种常见病原体阳性血清及多份免疫鸡、人工感染鸡、临床可疑病鸡血清和阴性血清进行了检测，结果证明，本法具有较好的特异性和敏感性，而且操作简便、快速，是一种适用于鸡传染性鼻炎的诊断、流行病学调查、检疫和监测的良好方法。

一般来说，常规诊断技术具有应用简便、快速、易于掌握、费用低等优点，是经历了漫长的历史发展过程得以巩固和完善的，因此，具有比较强的生命力。而生物高科技诊断技术却不具备这样的优势，不论是单克隆抗体还是核酸探针PCR等，其试剂的制备方法都比较复杂，需要昂贵的仪器设备和诊断试剂，对操作者的技术要求也较高，甚至对检测结果的综合评价也不很容易掌握(Her-schman，2003)。但是，现代生物技术作为一种高新技术，有着常规诊断方法不能比拟的优越性，分子生物学检测技术具有极高的敏感性与特异性，能够区别细菌和病毒的疫苗株和野毒株，甚至可区别病毒间单个核苷酸的差别，可以监测病原体的变异和漂移，预报疫病的大流行(杜立新，2003)，核酸探针和PCR技术还可检测出整合到宿主体内的病原体，对于进行毒株鉴定、检测隐性感染和免疫损害性疾病都具有重要意义。

因此，虽然在短时间内这些诊断新技术难以真正达到推广应用，但对于重大疫情的及时预报和准确定性都是不可或缺的。

[1]尹海芳, 王秋菊, 李宁.基因敲除鼠疾病模型的研究进展[J].遗传, 2002, 24: 463-469.

[2]李宁等.我国动物生物技术产业发展战略研究[J].中国农业科技导报, 2000, 2(6): 13-18.

[3]杜立新.关于中国地方畜禽品种的评价与保护的若干思考[J].中国畜牧兽医, 2003, 30(2): 3-6.

[4]Blasberg R.PET imaging of gene expression[J].Eur J Cancer, 2002, 38(16): 2137-2146.

[5]Calegari F, Hauhensak W,Yang D,et al.Tissue-specific RNA interference in postimlalantation mouse embryos with endoribonucleaseprepared shot interfering RNA[J].Proc Natl Acad SniUSA, 2002, 99(22): 14236～14240.

[6]Chatziioannou A F.Molecular imaging of small animals wilh dedicated PET Tomography[J].Eur J Nucl Med, 2002, 29(1): 98-114.

[7]Herschman H R.MicrO-PET imaging and small animal models of disease[J].Curr Opin Lmmunol, 2003, 15(4): 378-384.

[8]Hutvagner G,Zamore P D.AmioroRNA in a multiple-turover RNAi enzyme complex[J].Science, 2002, 297(5589): 2056-2060, 5864-5874.

[9]Jacobs A H, Li H, Winkeler A,et al.PET-based molecular imaging in neuruscience[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2003, 30(7): 1051-1065.

[10]Maclean D, Northrop J P, Padgett H C, et al.Drugs andprobes: the symbiotic relationship between pharmaceutical discovery and imaging science[J].Mol Imaging and Biol, 2003, 5(5): 304-311.

[11]Makimura H, Mizuno T M, Mastaitis J W, et al.Reducing; hypothalamic AGRP by RNA interference increases metabolicrate and de-creases body weight without influencing; food intake[J].BMC Neurosci, 2002, 3(1): 18-21.

[12]Ramaswamy G,Slack F J.siRNA-A guide for RNA silencing[J].Chem Biol, 2002, 9(10): 1053-1055.

[13]Trappe R, Schulze E, Rzymski T.The caenorhabditis elegansortholog of human PHF5a shows a muscle-specific expre-essicm domain and is essential for C.elegans morphogenetic development[J].Biochem Biophys Res Commun, 2002, 297(4): 1049-1052.

[14]Yu J Y, DeRuiter S L, Tumer D L.RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian ce11s[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002, 99(9): 6047-6052.