生物与胞外聚合物偶联降解石油污染土壤中常见有机物*
2014-04-06杨智临李亚龙白智勇王士东杨琦
杨智临 李亚龙 白智勇 王士东 杨琦
中国地质大学（北京）水资源与环境学院
生物与胞外聚合物偶联降解石油污染土壤中常见有机物*
杨智临 李亚龙 白智勇 王士东 杨琦
中国地质大学（北京）水资源与环境学院
将石油污染土壤中筛选出来的专一性降解萘菌株Rhodococcus、专一性降解菲菌株Nocardioides与胞外聚合物（EPS）联用，对石油污染土壤中常见的两种难降解有机物萘、菲的降解规律和动力学与菌株的生长曲线进行研究。实验结果表明，EPS与萘降解菌联用吸附降解萘的最佳萘初始投加量为2.14mg/L，最佳pH值为6，最佳温度为30℃；EPS与菲降解菌联用吸附降解菲的最佳菲初始投加量为0.06mg/L，最佳pH值为6，最佳降解温度为20℃。EPS与菌株联用对萘的去除率达96%时，菲的去除率达100%。
石油；胞外聚合物；萘、菲；降解
将石油污染土壤中筛选出来的专一性降解萘菌株Rhodococcus、专一性降解菲菌株Nocardioides与胞外聚合物（EPS）联用，对石油污染土壤中常见的两种难降解有机物萘、菲的降解规律和动力学与菌株的生长曲线进行研究。
1 实验与方法
1.1 试验试剂与仪器
仪器：立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（LDZX—40CI，上海申安）、恒温水浴振荡器（SHA—B，国华）、分析天平（FA1004，上海精科）、分光光度计（722s，上海精密科学仪器）、高速冷冻离心机（GL—20M，上海卢湘）、液相色谱仪（1525，Waters）等。
材料试剂：萘（育才精细化工）、菲（J&KCHEMICA）、牛肉膏、蛋白胨（均为奥博星）、无机盐等，无机盐及微量元素配比成分参见文献[1]。本实验所用药剂均为分析纯。
1.2 萘、菲的测定
以高效液相色谱定量测定萘、菲浓度，色谱柱为C—18反相色谱柱，紫外检测波长254nm，流动相为甲醇∶水=90∶10，流速为1.0mL/min。
1.3 EPS的提取
为了避免化学药剂对EPS性质的影响，采用物理方法提取EPS。本文选用蒸汽法，将活性污泥试样置于高压灭菌锅中，在120℃，100kPa的条件下加热10min左右，然后以9000r/min的转速离心15min，上清液用滤膜过滤，得粗EPS[2]后以0.45μm滤膜过滤，再放入4℃冰箱保存备用。
1.4 降解实验
250mL血清瓶中含有定量萘或菲、2mL菌悬液、2mL的EPS，并且加入216mL无机盐，使液体体积达到220mL。密封瓶口后放入恒温水浴摇床中开始实验。取样时刻为0、0.5、2、4、8、12和24h。
2 结果与讨论
2.1 菌对萘、菲的降解
（1）EPS与萘降解菌耦合降解萘。初始条件：EPS的投加量为42mg/L，萘的初始浓度为6mg/L，pH值为7，菌悬液接种量为1%，转速为150r/min。以时间（t）为横坐标，初始浓度/当前时刻浓度（c/c0）为纵坐标做图，在不同温度条件下菌种对萘的降解如图1所示。从图1可以看出，在反应开始12h内，30℃和35℃条件下的降解速率明显要高于20℃和25℃。其原因可能是在反应开始时，随着温度的升高，酶的活性较高[3]，因此，反应随着温度的升高开始；在30℃条件下，EPS与萘降解菌耦合对萘的去除率最高为75%。
（2）EPS与菲降解菌耦合降解菲。初始条件：EPS的投加量为42mg/L，菲的初始浓度为0.5mg/L，pH值为7，菌悬液接种量为1%，转速为150r/min。以时间（t）为横坐标，初始浓度/当前时刻浓度（c/c0）为纵坐标做图，在不同温度条件下菌种对菲的降解如图2所示。从图2可以看出，随着温度的降低，对菲的去除率逐渐上升，即EPS与菲降解菌联用去除菲的效果随着温度的升高逐渐降低；同时，在12h后，吸附量基本上不再变化，类似于达到了一种吸附平衡，这说明在降解过程中，EPS的吸附作用占据主导作用。
图1 EPS与萘降解菌耦合在不同温度条件下降解吸附萘
图2 EPS与菲降解菌耦合在不同温度条件下降解吸附菲
2.2 动力学研究
对EPS与菌株偶联降解萘分别进行一级动力学与二级动力学模拟。由模拟结果可知，对于不同温度下EPS与菌株偶联使用降解吸附萘的动力学模拟更加符合一级动力学方程，其R2值均在0.95左右；在20、25、30、35℃的情况下，反应速率常数k分别为0.025、0.0045、0.056、0.045，半衰期t1/2分别为27.7260、15.4033、12.3776、15.4033。
2.3 菌种的生长曲线
准备2个锥形瓶，向锥形瓶内分别接种1%的萘降解菌株和菲降解菌株，然后分别向2个锥形瓶中投加足够量萘菲来提供碳源，并且分别加入2mL的EPS，在30℃，150r/min摇床上培养[4]，定时对菌株的生长进行检测，利用OD600来表征菌量的多少。从图3、图4可以看出，两株菌生长均都有明显的对数增殖期（减速增殖期）、稳定期、内源呼吸期。另外，对于萘菌来讲，对数增殖期明显减少，在7天时细菌数量就开始趋向稳定，这说明EPS对于萘菌的生长有促进作用。这可能是由于EPS中大量的蛋白质和多糖等成分对萘菌起了共代谢的作用，使细菌的代谢速度增加，从而使细菌数量迅速达到饱和值。两种菌株基本上也都是在60天后衰减到了一定的值，细菌数量趋于稳定。
图3 EPS与萘共同作为碳源降解萘菌生长曲线
图4 EPS与菲共同作为碳源降解菲菌生长曲线
3 结论
（1）EPS与萘降解菌联用吸附降解萘的最佳萘初始投加量为2.14mg/L，最佳pH值为6，最佳温度为30℃；EPS与菲降解菌联用吸附降解菲的最佳菲初始投加量为0.06mg/L，最佳pH值为6，最佳降解温度为20℃。
（2）在本实验范围内，EPS与萘降解菌以及菲降解菌联用吸附降解萘的最高去除率为96%，对菲最佳去除率为100%。
（3）在萘、菲互相共代谢条件下，两种菌株的生长都有明显的对数增殖期（减速增殖期）、稳定期、内源呼吸期。
[1]王士东，杨琦，王诗宗，等．好氧污泥胞外聚合物提取方法比较及其对染色剂玫瑰红B的吸附[J]．安全与环境学报，2014，14（1）：172-176.
[2]曾艳，张明青．活性污泥胞外聚合物提取方法及其絮凝性能研究[J]．化工环保，2011，31（1）：87.
[3]张帆．污染土壤中萘、菲降解菌的筛选鉴定及降解特性研究[D]．北京：中国地质大学（北京），2013.
[4]白智勇，李博，杨琦．两株菌对萘的降解特性对比[J]．油气田地面工程，2013，32（3）：48-49.
（栏目主持 杨军）
10.3969/j.issn.1006-6896.2014.12.007
基金论文：重点防控重金属汞、铬、铅、镉、砷便携/车载/在线监测仪器开发与应用示范（2012YQ060115）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（2652013101,2652013086,2652013087）。
