蛋白激酶C受体1过表达载体、干扰载体的构建及鉴定

张 丽，贾雄飞，牛 华，郑 瑞，张望龙，毛小琴

(1 昆明理工大学，昆明 650500;2 中国人民解放军昆明总医院;3 云南省第一人民医院)

有活性的蛋白激酶C受体1(RACK1)属于Trp-Asp 40(WD-40)重复蛋白家族，其蛋白序列与G蛋白β亚单位具有高度同源性，并在所有真核细胞中高度保守［1］。我们前期研究发现RACK1蛋白在R-普萘洛尔和S-普萘洛尔处理的药效学细胞模型上存在明显的表达差异［2］，推测其可能与普萘洛尔抗心律失常药理学作用有关。过表达是将目的基因克隆到载体上，转染进入细胞，目的基因在表达载体的启动下启动表达过程，从而实现过表达。RNA干扰(RNAi)［3］技术因其高效且特异的靶基因抑制而在基因功能研究和疾病的基因治疗中显示出巨大的潜在应用价值。2012年10月～2013年11月，我们构建了RACK1过表达载体和小干扰RNA(siRNA)表达载体，旨在为进一步研究RACK1在心律失常中的作用及分子机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 载体 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-Zs-Green和PIRES2-EGFP、大肠杆菌JM109和人肝癌细胞株Huh-7.5.1(昆明理工大学夏雪山课题组惠赠);限制性内切酶 SalⅠ、BglⅡ、HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA Ligase、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、AMV第一链cDNA合成试剂盒和TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司);Trizol(Invetrogen公司);质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司);其他试剂为国产分析纯。

1.2 RACK1过表达载体的构建 人肝癌细胞株Huh-7.5.1 经 Trizol试剂提取获得总 RNA，使用AMV第一链cDNA合成试剂盒获得cDNA，使用外围引物 WF1:5＇-AGTGCCATCCTCGTCGCTGC-3＇和WR1:5＇-TTTGTAAAGCTCTGCCATAAACTTCTAG-3＇扩增;1%凝胶电泳确定条带大小正确后再用内围引物 NF1:5＇-GGAAGATCTATGACTGAGCAGATGACCCTTCGTG-3＇(下划线为 BglⅡ酶切位点)和 NR1:5＇-ACGCGTCGACTCAGCGTGTGCCAATGGTCAC-3＇(下划线为SalⅠ酶切位点)继续扩增，得到的PCR产物经BglⅡ和SalⅠ双酶切后与同样双酶切后的真核表达载体PIRES2-EGFP连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，涂平板筛选挑取阳性克隆，扩大培养后行菌液PCR，PCR产物经电泳观察基因片段大小。挑选PCR鉴定合格的菌液送上海生物工程有限公司测序。重组质粒命名为PIRES2-EGFP/RACK1。

1.3 RACK1干扰载体的构建

1.3.1 干扰靶点的选择 根据siRNA设计原则针对RACK1基因选择 2个靶点:靶点1为 5＇-GGGAUGAGACCAACUAUGG-3＇(RACK1-Ⅰ)，位 于CDS140-158;靶点 2 为 5＇-GGUAUGGAACCUGGCUAAC-3＇(RACK1-Ⅱ)，位于 CDS525-543，另设计通用 阴 性 对 照 5＇-GACTTCATAAGGCGCATGC-3＇(HK)。在寡核苷酸片段的5＇和3＇端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，便于与RNAi-ReadypSIRENRetroQ-ZsGreen载体连接，中间为9个插入序列TTCAAGAGA，形成发夹环。最后，在插入的目的DNA片段里，设计一个HindⅢ的酶切位点，位于EcoRⅠ和BamHⅠ位点之间，多聚T之后便于酶切鉴定。核苷酸由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3.2 单链目的基因片段的退火连接 将合成的3对单链DNA Oligos用 ddH2O稀释到10 μM/mL。各取 3 μL 加 12 μL ddH2O 及 2 μL T4 DNA ligase buffe于 PCR 仪中，按照94 ℃ 5 min，80、70、60、50、40、30、20、10、4 ℃各 2 min 的程序进行退火。

1.3.3 酶切和连接反应 质粒 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，37℃、4 h，1%琼脂糖凝胶回收线性化载体。将3对寡核苷酸双链分别和线性化载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 按2∶1 比例混合，1 μL T4 DNA连接酶16℃连接过夜。

1.3.4 重组质粒的转化和筛选 氯化钙转化法将重组质粒分别转入感受态细胞JM109大肠杆菌，涂布于含Amp抗性的LB平板，37℃恒温箱培养过夜，从每个培养皿上各挑取1个单克隆菌落扩大培养并提取质粒。

1.3.5 重组质粒的鉴定 重组质粒以HindⅢ单酶切后测序鉴定，获得3个重组质粒pRetroQ/RACK1-1，pRetroQ/RACK1-2和 pRetroQ/HK。

1.4 重组质粒与对应空载体转染HUVEC细胞HUVEC细胞培养于含10%FBS的DMEM完全培养液中，在转染前1 d铺于6孔板，每孔2×105个细胞，于37℃、5%CO2条件下培养约24 h。用DMEM洗细胞2次，加入无血清和双抗的DMEM 2 mL。按照脂质体LipofectamineTM2000说明书，分别将重组质粒 4 μL(1 μg/μL)和脂质体 10 μL 加入 250 μL Opti-MEⅠ中混匀，静置5 min。将两液混合，室温静置20 min，轻轻覆盖细胞表面，放回培养箱中继续培养6 h后，换用含10%FBS的DMEM完全培养液。同时转染空载体做对照。48 h后于倒置荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 RACK1基因编码区序列的分离及其过表达载体的鉴定 经外围引物WF1和WR1扩增人RACK1基因cDNA后，再用内围引物NF1和NR1继续扩增，得到自起始密码子(ATG)到终止密码子(TAG)之间954 bp的CDS序列。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，与目的基因大小一致;经琼脂糖凝胶电泳验证，过表达载体 PIRES2-EGFP/RACK1的菌落PCR产物与目的条带一致;测序结果经blast比对分析，插入序列与目的基因序列完全相同，表明过表达载体构建成功。

2.2 小干扰 RNA表达载体的鉴定 pRetroQ/RACK1-1、pRetroQ/RACK1-2和pRetroQ/HK干扰载体用HindⅢ进行单酶切后，均酶切为约2.5 kb和4.2 kb的2个片段，与预期结果一致。测序结果与设计的寡核苷酸序列一致，证明RACK1的小干扰RNA真核表达载体构建成功。

2.3 重组质粒对HUVEC细胞的转染结果 以未转染细胞为对照，48 h可见绿色荧光蛋白表达约50%～80%，并分布于整个细胞，呈胞质分布，表明过表达载体和干扰载体构建成功并能在HUVEC中表达。

3 讨论

RACK1是一种被证明的胞质支架蛋白，能与有活性的蛋白激酶C(PKC)相互作用，并结合于PKC上，参与 PKC的转位和活化［4］。在心肌细胞中，PKCs可调控 RACK1 的表达［5］。RACK1 除了与PKC相互作用外，还与其他多种蛋白或信号分子相互作用，如磷酸二酯酶 PDE4D5［6］、MCM7［7］、脂联素受体 1［8］和 FAK［9］等，是 Src 酪氨酸激酶的一种重要底物，向下传递生长因子受体酪氨酸激酶的信号，参与Src功能调节和细胞生长的调节［10］。此外，RACK1 还能调节 Ca2+的释放［11，12］，而细胞内外Ca2+浓度对心肌兴奋性、血管伸缩状态至关重要。人RACK1蛋白由鸟嘌呤核苷酸结合蛋白βⅡ(GNB2L1)编码，后者有8个外显子和7个内含子［13，14］，其 CDS 全长 954 bp，编码 317 个氨基酸的蛋白。GNB2L1位于染色体5q35.3，在接近5号染色体的端粒处［13］。RACK1在大多数组织中高效表达［13］，且序列严格保守［14］。

构建过表达载体时我们从人RACK1 mRNA序列(NM_006098.4)中选取CDS区段作为目的片段，并在两端各加上限制性酶切位点便于与双顺反子表达载体PIRES2-EGFP连接。PIRES2-EGFP为双顺反子载体，故真核表达载体PIRES2-EGFP在翻译时与EGFP同时进行，在同一条mRNA链上以2个阅读框进行翻译，所表达的蛋白质为非融合蛋白，避免了与外源性标记蛋白融合而影响RACK1的生物学活性。此外，本实验构建的过表达载体PIRES2-EGFP/RACK1同时带有绿色荧光蛋白基因和新霉素抗性Neor基因作为双选标记，因此可在转染细胞后通过Neor筛选出基因阳性克隆细胞。

RNAi目前主要通过两种方法得以实现:一种是体外化学合成法人工制备siRNA，此法操作简单、快速，但RNAi效应往往是暂时的;一种为细胞内表达的siRNA［15］，后者干扰效率高、作用持久、可稳定遗传给子代且并未发现明显的细胞毒效应［16］。若后续实验周期长或是特殊要求则优先考虑构建siRNA表达载体，本文考虑到后续膜片钳等实验，故构建表达siRNA的真核表达载体。在干扰序列的选择上，我们选择的序列曾被作为靶系列化学合成siRNA，并且在前列腺癌细胞LNCaP中证明干扰效果好［17］。RACK1在不同细胞中表达水平不同，同一个干扰载体在不同细胞中的干扰效果可能也不同，故我们构建了3个表达siRNA的真核表达载体(两个干扰载体，一个阴性对照载体)，以便筛选出一个干扰效果最好的载体用于后续研究。

本研究成功构建了能在体内长期表达的RACK1过表达载体PIRES2-EGFP/RACK1和RNA干扰载体 pRetroQ/RACK1-1、pRetroQ/RACK1-2和pRetroQ/HK，这为后续从正反方面研究RACK1在心律失常中的功能奠定了实验基础。

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