腺病毒的检测与鉴别技术简介

杨新忠 （山东省滨州市滨城区滨北办事处畜牧兽医站 256600）

腺病毒科分为哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。有关病毒的形态、基因的长度、基因的组成等与鉴别相关的病毒特征各型腺病毒是不同的。因此，鸡腺病毒、火鸡的出血性肠炎病毒和减蛋病毒等腺病毒的鉴别由于经济价值的原因而具有不同的意义。由于腺病毒抗体的产生，血清学方法成为腺病毒诊断中的重要方法之一。近来，腺病毒诊断领域的主要是用分子生物学方法对相关病原体的直接检测。和其它病毒一样，对腺病毒诊断所选择的方法亦是PCR。因此，本文主要讨论腺病毒的直接检测和媒剂的识别。

腺病毒(FAV)是一种多血清群病原体，它给禽业生产带来了各种困扰。在很长一段时间内，诊断腺病毒感染绝大部分局限于各种血清学方法，近年来，有报道用限制性内切酶分析来鉴别腺病毒。现已表明，许多 PCR技术用于诊断所有的三群腺病毒，且确认大多数PCR可以检测腺病毒DNA。其中有些PCR结合限制性内切酶分析可以区分FAV参考株与野毒株。出血性肠炎病毒和减蛋病毒的检测方法证实了直接从组织样品中检查病毒DNA的优势。其它PCR随着靶细胞中三群腺病毒DNA的检测目标而不断发展。尽管现在仍存在许多问题和疑问需要解决，但PCR在腺病毒诊断中的价值是显而易见的。

1 形态和分类

（1）腺病毒是直径在70-100nm的无囊膜廿面体粒子。主要的结构蛋白是六邻粒上的纤丝。所有哺乳动物腺病毒只有一条连在五邻粒上的纤丝，而FAV有一独特的形态，每个五邻粒上有两条纤丝。纤丝的顶端是蛋白远端的C末端部分，带有特异γ抗原，它具有相应的血凝活性。六邻粒蛋白是确定无囊膜廿面体病毒属型、群还是特异亚群的主要壳蛋白。（2）病毒粒子含有25～43.8kpb大小不等的基因片断。根据排序资料和基因组的构成，腺病毒的最终分类还在讨论之中，但有许多报道建议将其分为三个不同的属。基因序列的研究与分子学诊断有直接的关系，因为它为创建核酸探针、寡核苷酸等工具提供了必要的基因信息。（3）腺病毒分为三个不同的群反应了该病毒生物学的多样性。Ⅰ群腺病毒包括从鸡、火鸡、鹅、鸭、鸽子等禽种分离得到的常规腺病毒。A型特异群抗原是这类病毒的共同特征。HEV、雉的大理石脾病毒和鸡大脾病毒属于Ⅱ群。Ⅲ群只有减蛋病毒。腺病毒之间的巨大差异在鉴别上很有意义。然而，国际病毒分类协会只是根据分离病毒的禽种和血清学差异来划分腺病毒。

2 禽的疾病

（1）大多数Ⅱ群或Ⅲ群腺病毒都直接导致产生特异疾病，而大部分Ⅰ群腺病毒的致病性仍然存在疑问，尽管FAV1血清型的许多毒株能够导致鹌鹑支气管炎。（2）包涵体肝炎是3～7周龄的鸡受FAV感染引发的一种疾病。此病在其它禽种也有发生，包括火鸡、鸽子、鹅、鹦鹉、茶隼和灰背隼。有研究者分离到相应的腺病毒并各自定型为FAV8、FAV2、FAV3和TAV株。在其它病例中除了做电子显微镜或组织学特征的观察外并没有进一步的分型。许多毒株和血清型都是在爆发地报道的，但有些FAV8强毒株却是从澳大利亚和新西兰3周龄以下的鸡IBH的非典型病例中分离得到的，而抗体的广泛产生和从临床健康鸡中FAV的分离推翻了FAV在发生疾病时的首要作用。（3）与此相反的是许多FAV株却在心包炎、安卡拉病或心包积水综合征这一类疾病中起主要作用。此类疾病主要影响3～5周龄鸡，死亡率达75%。除了印度和巴基斯坦，伊拉克、科威特、日本和美洲大陆上的墨西哥、秘鲁、厄瓜多尔、智利都有爆发此病的报道。（4）出血性肠炎是6～8周龄火鸡易发的疾病，全世界范围内皆有发生。除了肠道出血，HEV感染还可通过B淋巴细胞的复制而导致免疫抑制。（5）1976年，首次报道了以产蛋率大幅下降为特征的EDS。此病病毒在鸭体内抗体的广泛产生和在鸭细胞的良好生长从而导致在病毒分类中将其划分为鸭腺病毒1(DAV1)。据流行病学显示，此病毒最初有可能经污染的疫苗传入鸡群的。本病已经在欧洲、亚洲和南美洲的许多国家有所报道。

3 传统诊断方法

（1）由于腺病毒特征性的形态，用电子显微镜能很容易的将其诊断出来。然而，没有纯化的病毒，只有形态学的特征不能得出它属于某一血清型的结论。另一个非特异方法是用苏木精和伊红染色可疑的细胞培养物来证实典型的核内物质。对鸽子和鹦鹉来说，电子显微镜和组织学是用来研究能否用包涵体的电镜特征和组织学特征将腺病毒感染与其它病毒感染诊断和鉴别出来。（2）关于群特异性的进一步检测是间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的应用，它适合于检测每克肝组织的腺病毒感染量低于100pg的组织培养物。与后来发现的免疫细胞化学技术一样，ELISA能够检测12种血清型共同的特异群抗原。（3）病毒的分离是进一步分型的必要步骤。FAV易从鸡胚肝细胞(CEL)中分离出来。实验表明，鸡蛋经卵黄囊接种病毒后，孵化的鸡胚是一种敏感的媒介。研究表明，用细胞能够培养繁殖FAV，但用此技术却不能获得野毒的初次分离。尽管从其它禽的肾细胞中成功分离到FAV，但另一项研究却证实了CEL细胞对鸽子的6株FAV和五种血清型的初次分离容易得多。基于分离的目的，腺病毒在鸡肝瘤细胞中也可能生长。在这些细胞中，FAV8的抗体滴定度要比CEL细胞中获得的高。（4）如果同源禽种不能获得细胞培养物，其它禽种的I群腺病毒应该能从CEL细胞中分离出。DAV、火鸡腺病毒(TAV)和鸽腺病毒(PiAV)都显示了CEL细胞比CK细胞的优越性。（5）关于I群腺病毒在成纤维细胞中的生长行为已获得了许多数据。DAV和鹅腺病毒(GAV)能从同源禽种的成纤维细胞中分离和繁殖出来，而鸡成纤维细胞对腺病毒的敏感性却低于CK和CEL细胞。用各种腺病毒感染鹌鹑成纤维细胞群不能确定收病原影响的程度。（6）分离病毒后，再用免疫荧光分析来确定群的特异性。至少微量滴定板上的中和试验能够决定精确的血清型。在FAV分型中，不同参考株的使用是一个问题。要建立一个新的血清型，必须遵循ICTV规定的条件。如果是腺病毒，应像证实DAV1、GAV、TAV、PiAV和许多FAV一样，做交叉中和反应试验且滴定比率(同源:异源)应高于16。由于II群腺病毒在淋巴母细胞中的限制性生长，其分离也相应受到限制。尽管能用火鸡和鸡白血球繁殖病毒，但效果较差。HEV抗原大多数由AGP试验直接检测。ELISA比AGP试验有更高的灵敏度。免疫组织化学用于研究病毒在固定组织中的分布和疾病的病原。（7）EDS病毒能够凝集红细胞，而其它腺病毒没有这种异源凝集活性。只有某些FAV1株能够异源凝集兔的红细胞。输卵管中EDS病毒分离物的敏感部位是水禽的蛋和组织培养液，但是，CEL或CK细胞同样适合于繁殖EDS病毒。

4 核酸诊断技术

（1）到目前为止，有许多报道证明可用核酸技术来检测和鉴别腺病毒。首先用限制性内切酶分析来鉴别分离物和毒株。对比血清学方法，REA能检测出基因上更多的差异，且不仅是位于结构蛋白上的基因。血清学中相关的主要结构蛋白只表现出腺病毒基因组的15%。REA依靠的是所选择的限制性内切酶和数量和类型，即切割片断的核苷酸序列。（2）鉴于12种血清型毒株的数量，REA对FAV的鉴别很有效。Zsak和Kisary根据12种血清型的BamHI和HindⅢ限制性模式，将其分成5个不同的群。同一种限制性内切酶用于区分鹅腺病毒和TAV1、2三种血清型的特征。有许多研究报道，根据限制性模式有时结合双向复合移动的限制性片断的测定来划分腺病毒。E群DNA的FAV株限制性内切酶的研究表明REA能够鉴别FAV弱毒株和强毒株。FAV4和FAV10的酶切说明这两种血清型应合为一种。用许多限制性内切酶能够制定出FAV1、FAV8和FAV9的全部基因组的限制图谱。其中有些用于基因组的克隆和排序。（3）关于REA鉴别的HEV和mSDV株基因组的不同曾有过报道。REA对血清型不同的病毒鉴别有助于提供更多的关于病原性不同的毒株流行病学方面的信息。而前面提及的关于群腺病毒分离时的困难对REA的广泛应用也是一个主要的障碍。（4）许多地方公布了名为127和B8/78的两株EDS病毒的形态图和REA。有一部分调查用于比较EDS病毒和FAV1或从不同地区分离的EDS病毒野毒。（5）利用原位杂交对组织中腺病毒DNA进行直接检测已有过报道。探针在这些研究中的利用是基于FAV10五邻体的核酸序列和FAV1的病毒RNA。在另一项研究中，减蛋病毒感染被认为是证实生物探针对比免疫细胞化学总体优势的例证。HEV DNA的564-6P探针用于病毒的组织趋性研究。（6）已报道用PCR检测腺病毒，大多数PCR的建立是为了检测原始的FAV。就HEV而言，PCR是用于提高原位杂交研究的灵敏度。这个PCR是为了脾单核细胞的HEV DNA的检测和HEV靶细胞的确定。做的另一项研究是检测特异的HEV DNA，为此，包括了所有的FAV血清型，以加强PCR的诊断特征。EDS病毒DNA的选择性检测和第一个FAV的PCR方法同时发布。近来又创建了一种适合于所有三群腺病毒DNA片断扩增的PCR。

5 作为诊断工具的PCR

（1）选择一个合适的基因。为诊断而创建PCR技术被认为是腺病毒流行病学的一大特色。有许多腺病毒 例如FAV没有物种特异性，即它们能够感染其它的不同禽种。比较而言，HEV和少数EDS病毒 有固定的宿主。总之，鸡能感染EDS病毒和FAV株。火鸡是HEV和TAV1、2的第一宿主，FAV感染也有报道。因此，基于诊断的目的，PCR能够鉴别出感染相应宿主的所有腺病毒。（2）考虑到前面的资料，必须精确定义PCR的目标。根据腺病毒谱和宿主的分布，灵敏度和特异性是两个相对的目标。检测特异腺病毒的目标是一个单一的FAV血清型还是所有的FAV血清型呢？或者PCR的目标是不是要检测所有的腺病毒呢？在这一点上，问题是选择哪一个基因作为引物。如果第一个重点是所有FAV血清型的检测都根据PCR产物的差别，或扩增产物的酶切的话，那么有必要做更多的考虑。不同腺病毒之间高度保守的基因将会提高所有被检病毒的灵敏度，但是很难进行鉴别。反之，一个序列性差的基因不能设计出一种能从12种血清型中产生一个PCR产物的寡核苷酸，但它对鉴别很有帮助。为达到这两个目标，选择的基因应包括保守和变异两个部分。保守基因应围绕着变异基因，变异基因用于PCR后通过PCR扩增物的REA试验来鉴别不同的血清型。（3）资料显示，大部分腺病毒的PCR将六邻粒基因设计为引物。以蛋白的结晶学研究为基础，创建主要壳蛋白的三维立体结构。根据这个模式，六邻粒包括保守片断，它位于病毒的里面，和变异环，它突出在病毒的表面，含有特异的中和抗原决定基。由于免疫系统间的相互作用，不同血清型尤其是不同宿主上的腺病毒的环区序列性较差。因此，模板和环满足了前面建立PCR时所定义的标准。迄今为止，已经获得了四种不同腺病毒的完整核苷酸片断。这四种病毒分别是FAV1、EDS病毒、HEV和FAV8。另外，FAV10六邻粒基因片断已有报道。（4）在另两个报告中，前引物与PⅢa基因杂交，反向引物与五邻粒基因杂交。根据核酸序列资料，PⅢa基因在不同的腺病毒间很少有重复，而五邻粒基因的序列性却在其它结构蛋白的范围内，然而只有精确的杂交片断与从目的DNA获得扩增产物有关。因此，应该用一个选择的引物测试尽可能多的不同腺病毒，以检查PCR的检测范围。

6 引物限制

（1）最初，FAV1和HAd2五邻粒蛋白是成一行的，并且决定了FAV六邻粒蛋白模式和环区。引物对H1/H2和H3/H4位于FAV1六邻粒基因的保守区内。PCR产物包括变异环区L1和L2或L3和L4。PCR之后的第二步，序列性差的环区利用REA 鉴别12 种血清型，而几乎所有的H1/H2PCR产物都有表现不同的HaeⅡ外形。H3/H4PCR产物的HpaⅡ酶切更加相似。这个结论与报道的扩增区的序列相一致。（2）为了HEV或EDS病毒DNA的特殊检测，引物被设计在FAV六邻粒蛋白的环区内杂交。此区的特征是EDS病毒和FAV六邻粒蛋白间序列性很差。这些引物的目标是避免感染火鸡或鸡的其它腺病毒的检测。没有PCR产物用表现12种血清型的所有参考株的DNA来扩增，EDS病毒的DNA反应呈阳性。片断的长度与基因的核苷酸序列一致，所以选择同样的方法为HEV的检测创建一个物殊的PCR。再者，只有HEVDNA呈阳性反应，而其它的Ⅰ群腺病毒TAV1，2和FAV1-12没有片断扩增。由HEV六邻粒核酸序列推测出来的1647bp片断只有在使用Dindoral特异病原体活苗作目标时才出现。为准确的鉴别这些病毒，有必要使用双向交叉反应。因为引物的位置限制，EDS病毒或HEVDNA片断不能应用引物对H1/H2或H3/H4加以扩增。

7 PCR用于检测鸡和火鸡的主要致病性腺病毒

（1）近来有报道说FAV4是安卡拉病或传染性心包炎的主要病因。FAV4株在两个大陆不同国家相同疾病的临床病例中的分离在FAV致病区是一个奇迹。一般用PCR结合REA试验来检测不同国家的FAV4株。所有的分离物都有用H1/H2或H3/H4引物对来检测。根据Raue和Hess的理论，H3/H4PCR产物和HpaⅡ的消化提供了印度和巴基斯坦与其它地方分离物的众多不同。然而，所有分离物都有可能表现出与H1/H2PCR产物相同的外形，而被定型为FAV4株。用PCR和REA鉴别的参考株与野毒株的差异也在FAV1和FAV9两株病毒上表现出来。像报道的FAV株，其区别只限于一个PCR产物的消化。（2）一般地，PCR的创建应从被选择纯化病毒DNA上一个PCR产物的扩增开始，如EDS病毒。第二，PCR应适应组织培养物。这是PCR比传统诊断方法最主要的优点。（3）为了实际条件下EDS病毒的PCR试验，所有的DNA都从EDS临床症状的鸡的输卵管内提取出来。预想的扩增产物从临床病例中获得，而阴性对照仍保持阴性。（4）相同的研究方法用于检测HEV，一种火鸡的潜在病原性腺病毒。调查了许多HE病例并且从中扩增了1650bp的PCR产物，其中以1日龄火鸡的脾作对照。

8 展望

（1）近来腺病毒诊断的发展主要是分子水平上的。发表了许多PCR，完善了与禽业生产有关的所有腺病毒的诊断系统。然而，关于腺病毒的种类和禽种谱系仍有许多问题没有解决。（2）PCR结合PCR产物的REA能够检测和分型FAV分离物。这种结合的价值在传染性心包炎临床病例FAV4株的分离中也得到证实。许多分离物与参考株的不一致性对精确分型是一个难题。关于H1/H2和H3/H4两个PCR产物的外形，其区别很不明显。然而，需要研究更多的属于不同血清型的毒株以决定这种分型方法更精确。不过，对于变异性，PCR结合PCR产物的REA是不可能代替血清分型的。这种技术可能对做过感染试验后检测病毒的生长和持久性研究有帮助。（3）迄今为止，还没有获得12株FAV中任何一株特异血清型的PCR。这种PCR随着属于同一血清型的高致病性FAV株的发生而逾发重要。为此，血清型中无序列差异的基因应构建为引物。带有特异抗原决定基的纤丝区可能是个潜在的引物。事实表明纤丝是FAV8株不同病原性的对应基因，而基因长度的不同与不同的致病力无关。如果这些区域适合设计毒株鉴别的引物，那么有必要对更多的FAV核苷酸序列做出评估。（4）不同FAV血清型的混合感染可以发生在同一禽种上。这种混合感染通过PCR用无噬菌斑的纯化分离物进行检测。FAV血清分型的常规方法是病毒的分离，主要从肝脏上分离，然后再按照mcFerran的方法做中和试验。（5）有时为分离鸡细胞培养物，尤其是CEL细胞中的FAV需要多次传代。可以推测出传代过程中可能导致某一毒株的缺失。而随着传代次数增加，另一株的生长可能更加旺盛。比较病毒分离和PCR，如果只检测两个毒株，这可能是PCR的一大优势。考虑到样品中病毒DNA的不同数量，两毒株应该用相同的灵敏度检测，这就意味着引物应与相同长度的每一种目的基因杂交。（6）由于存在12个FAV血清型和广泛的毒株种类，所有目的基因 间杂交片断100%的序列或多或少是假设的，因此，需要对每个引物结合物做灵敏度测试。Xie等发表了属于Ⅲ群腺病毒的16种不同血清型的100ngDNA的检测。用同一个引物合成检测21种野外分离物且利用Southern印迹杂交提高其灵敏度。FAV1DNA作为创建引物的探针而决定灵敏度的高低，因此，对FAV1的检测范围是小于10fg。其它的FAV血清型或Ⅱ、Ⅲ群腺病毒没有给出灵敏度的资料。Jiang等报道了用特异的FAV8寡核苷酸检测100pg范围内的纯化病毒DNA或250个感染细胞。做过PCR产物的斑点印迹分析后，灵敏度有10倍的提高。（7）目前，其它Ⅰ群腺病毒如GAV1-3、TAV1，2、DAV1和PiAV好像没有迫切的需要特异的PCR。如果腺病毒能引起一种特异的临床问题，就像鸽子的腺病毒一样，那么这种形势会有所改变。（8）至今为止，还没有获得关于HEV和EDS病毒PCR灵敏度的资料。鸡对EDS病毒没有持续性抗体的潜伏感染加强了对这些资料的需要。就HEV而言，高灵敏度可能有助于诊断低死亡率的野毒传播，或保持一致的低死亡率的HEV感染或细菌的继发感染。（9）至少对FAV来说，应用PCR检测不同组织中的病毒DNA需要进一步的研究。在传染性试验中，它将有助于避免原细胞中病毒的分离，其优势已在HEV和EDS病毒感染中体现出来。