恶性胸腔积液中肿瘤细胞及其相关因子的检测及应用

马雪曼综述 张培彤审校

胸腔积液是恶性肿瘤临床常见的并发症之一，几乎所有的恶性肿瘤(除原发脑肿瘤)均可以引起胸腔积液。在成人胸腔积液中，我国报告25%～30%为癌性胸腔积液，国外报告为25%～53%[1]。因此其良恶性的鉴别至关重要，而鉴别的关键在于胸腔积液中是否存在肿瘤细胞。肿瘤细胞的浸润在恶性胸腔积液的产生中起着重要作用，同时它也是多种恶性肿瘤诊断与鉴别诊断的重要依据[2]。除此之外，胸腔积液肿瘤细胞相关的因子检测在胸腔积液临床诊疗中亦有重要的指导意义。由于胸腔积液的成分比较复杂，其中肿瘤细胞的数量较少，为胸腔积液良恶性的鉴别带来了困难，同时胸腔积液中各种相关成分的临床意义有待阐明。

1 胸腔积液肿瘤细胞的富集方法

胸腔积液肿瘤细胞的富集方法从最初的密度梯度离心法不断改进，引入了新的技术和仪器，其特异性、敏感性、有效性都得到了提高。1983年Nagasawa等[3]首次将密度梯度离心法应用于胸腔积液肿瘤细胞的富集，这种分离过程既简单易行又高效，即用三密度层(1.050，1.080和1.124 g/ml)Percoll不连续密度梯度分离液对肺癌患者的胸腔积液进行细胞分离，离心后恶性细胞高度富集在1.050 g/ml的细胞层，位于1.080 g/ml的细胞层主要是白细胞和小部分肿瘤细胞，所有的红细胞分布于1.124 g/ml层。有学者[4]在密度梯度离心法的基础上进行改进，使用二次离心法对肺癌胸腔积液中的肿瘤细胞进行分离，初次分离的细胞经过孵育后再分离能提高肿瘤细胞的纯度，二次分离方法采用不同浓度的 percoll 液进行分离，在淋巴细胞几乎被除去的同时可有效滤除凋亡及死亡细胞，提高肿瘤细胞的活力。近年来，半自动激光捕获显微切割技术被引入到胸腔积液转移性肺腺癌细胞的检测和富集，此项技术在选择肿瘤细胞时有较高的灵敏度，因其是半自动的，所以仅需要最低限度的人工技术监督[5]。Yang 等[6]应用免疫磁珠法对恶性胸腔积液肿瘤细胞进行了阴性富集，将DAPI标记的A549细胞添加到20 ml心衰患者的胸腔积液中，肿瘤细胞回收率为81%，而利用密度梯度离心法的肿瘤细胞回收率仅为61%，其效率远低于免疫磁珠法。在国内外学者对富集方法的不断改进下，胸腔积液肿瘤细胞的获得率及获得数量得到有效提高，同时达到了纯化肿瘤细胞的目的，而高科技方法的引入也使得这一过程简便易行。

2 胸腔积液肿瘤细胞及其相关因子在恶性肿瘤诊断中的应用

2.1 细胞学诊断

在胸腔积液的良恶性鉴别中细胞学诊断是最常用的方法，为证明该方法的有效性，Segal 等[7]通过一项历时20年的调查，面向6285名胸腔积液患者，其中815例诊断为癌性胸腔积液，在癌性胸腔积液中517例完成了胸腔积液细胞学诊断(63%)，377/517例进行了病理学明确诊断，得出胸腔积液标本细胞学诊断绝对灵敏度为73%。因此我们可以认为胸腔积液标本细胞学诊断是1种有效的、微创的、经济的癌性胸腔积液诊断方法。细胞学诊断的方法包括涂片染色法、免疫荧光法、免疫细胞化学法和基因检测法。

2.1.1 涂片染色法 通过涂片染色法观察细胞形态是细胞学诊断的基础，因其操作简便、重复性高、成本低廉而被普遍使用。梁家银等[8]对病因不明的439例胸腔积液进行了细胞学检查，用胸腔积液沉淀物涂片做HE染色和瑞氏染色，共查出恶性肿瘤118例，阳性检出率为62.8%。在118例中，腺癌96例，占 81.63%；鳞癌4例，占3.93%；分类不明癌15例，占12.17%；其它恶性肿瘤3例，占2.45%。胸腔积液恶性肿瘤细胞中腺癌占大多数。胸腔积液中腺癌细胞阳性检出率女性明显高于男性。瑞氏染色和HE染色结合不仅可正确分别细胞学类型，而且可以最大限度地降低诊断的假阴性。杨茂省等[9]回顾性分析胸腔积液直接分类法和离心涂片染色分类法在临床应用中的不同价值，结果采用直接分类法检测的918例胸腔积液标本，均未检出肿瘤细胞；采用染色分类法检测1405例胸腔积液标本，83例检出肿瘤细胞，并得到临床确诊，由此可以认为，对于胸腔积液的常规检查采用离心涂片染色分类法比直接分类法临床应用价值更高，不仅能区分结核性和化脓性胸膜炎，且能对良、恶性肿瘤早发现、早诊断。

2.1.2 免疫荧光法 免疫荧光法是1种通过细胞表面特异性抗原来识别肿瘤细胞的方法，用荧光染料对细胞染色后，特异性抗原能在荧光显微镜下发出荧光。苏明权等[10]采用吖啶橙荧光法(AOF) 、免疫荧光法(IGF) 、血卟啉荧光法(HOF) 检测胸腔积液肿瘤细胞，结果 11例乳腺癌中3种方法的阳性率均为100%，42例肺癌阳性率分别为95.2%、95.2%、92.8%，68例肺结核阳性检出率分别为 4.41%、2.94%、1.47%，18 例肺部感染阳性检出率分别为1.11%、0.55%、0，5例自发性液气胸和5例慢性肺源性心脏病均为阴性，由此证明，3种荧光法在诊断良恶性胸腔积液及胸腔积液肿瘤细胞类型方面都有较高的临床价值，但对良性胸腔积液类型的检出率却很低。

2.1.3 免疫细胞化学法 Ensani 等[11]采用免疫细胞化学的方法将3个间皮细胞抗体(D2-40，calretinin和WT-1)和2个非间皮细胞抗体(MOC-31和EMA)用于评估胸腔积液中的恶性细胞，结果发现D2-40的敏感性和特异性均达到100%，被认为可以作为鉴别间皮和非间皮起源细胞的一个准确标记。Sawangpanich等[12]对胸腔积液标本采用了细胞学检查显示恶性有小圆蓝细胞，免疫细胞化学法显示波形蛋白阳性反应，结合逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)证实存在PAX/CD56 FKHR融合转录本，成功为一位泰国患者确诊了腺泡状横纹肌肉瘤。

2.1.4 基因检测法 抑癌基因和促癌基因的激活与失活在癌症的发展中起着重要作用，因此胸腔积液细胞的基因检测有助于胸腔积液的良恶性诊断。Li等[13]探讨了脆性组氨酸三联体(FHIT)及p16 mRNA的缺失、K-ras基因突变在良恶性胸腔积液中的诊断价值，50例恶性胸腔积液患者和30例良性胸腔积液患者参加了这项研究，研究对所有胸腔积液标本进行平行的细胞学评价，用PCR法进行基因检测，结果发现FHIT和p16 mRNA在恶性胸腔积液患者中缺失率明显高于良性胸腔积液患者，K-ras突变比良性胸腔积液更频繁，而这3个基因标记组合的敏感性达到74%，因此基因检测可对恶性胸腔积液的细胞学诊断起到辅助作用。K-ras基因的突变与人类肺癌的发病机制有关，并被认为是影响预后的重要因素，其突变的位点受到国内外学者的关注。有学者就此问题进行了一项针对40例胸腔积液患者的研究[14]，对胸腔积液标本使用PCR技术检测了K-ras基因密码子的点突变，研究表明，胸腔积液可以有效地作为一个搜索癌基因点突变的临床标本，K-ras基因的第12位密码子突变在恶性胸腔积液中容易检测到，对恶性胸腔积液的诊断有重要的启示作用。抗脱落凋亡被认为是肿瘤转移的1个重要原因，恶性胸腔积液中的肿瘤细胞被认为具有抗脱落凋亡能力，有学者[15]检测TC-1基因在胸腔积液肿瘤细胞中表达水平明显高于原发灶肿瘤细胞，应用TC-1通路相关抑制剂PD176074可促使悬浮着的胸腔积液肿瘤细胞出现大批凋亡及坏死，而PD176074对贴壁培养的原发灶肿瘤细胞则无影响，由此证明了TC-1基因在胸腔积液肿瘤细胞抗脱落凋亡中扮演着重要角色。

2.2 胸腔积液相关因子检测的辅助诊断功能

目前恶性胸腔积液的细胞学诊断虽然被普遍使用，但其阳性率仅为40%～70%，那些细胞学检查阴性的患者尚不能被排除恶性的可能，良恶性的判断对治疗及预后起着决定性的作用，因此在鉴别良恶性胸腔积液方面仅仅依靠细胞学诊断是不够的。许多学者提出应在细胞学诊断的基础上结合多种辅助诊断项目来提高恶性胸腔积液的检出率，如胸腔积液肿瘤标志物、生化及血管内皮生长因子[16]等。

2.2.1 胸腔积液肿瘤标志物 肿瘤标志物作为诊断恶性肿瘤较敏感的指标被广泛应用于临床，以胸腔积液为临床标本的肿瘤标志物检测在鉴别良恶性胸腔积液方面具有较好的诊断价值。有学者[17]研究了肿瘤标志物在肺腺癌相关的细胞学阴性的胸腔积液中的诊断价值，选取HER-2/neu、CYFRA 21-1、和癌胚抗原(CEA)为检查指标，以74例肺腺癌胸腔积液(细胞学阳性41例，阴性33例)和99例良性胸腔积液为研究对象，结果HER-2/neu、CYFRA 21-1、CEA平均水平在癌性胸腔积液中显著高于良性者，在细胞学阴性的癌性胸腔积液中CEA联合CYFRA 21-1的诊断敏感性增加66.7%，在良性胸腔积液中这些标志物的平均假阳性率仅为2.7%，此项研究有力地证明了胸腔积液肿瘤标志物的诊断价值。临床中通常以血清为标本来测量肿瘤标志物，为验证胸腔积液在此方面的诊断价值，有学者[18]对28例癌性胸腔积液患者和30例良性胸腔积液患者分别进行血清和胸腔积液中肿瘤标志物(CEA、CA125、CA199、CA153等)的检测，结果显示癌性胸腔积液患者血清和胸腔积液中肿瘤标志物均明显高于良性胸腔积液患者，而在癌性胸腔积液患者中，胸腔积液肿瘤标志物亦显著高于血清肿瘤标志物。分析其原因可能为在恶性胸腔积液时，肿瘤细胞已侵犯胸膜，癌细胞直接将肿瘤标志物释放至胸腔内，且胸膜腔内的大分子标志物不易入血，而入血的肿瘤标志物也易被肝脏灭活，所以它在胸腔积液中的浓度显著高于血清。如果血清内肿瘤标志物水平明显升高，则可推断疾病可能已进入中晚期，因此测定胸腔积液中的肿瘤标志物对胸腔积液的早诊断、早治疗更有意义。

2.2.2 胸腔积液生物标志物 胸腔积液中富含种类繁多的生物标志物，其中一些与肿瘤细胞密切相关，国内外学者进行了大量实验及临床研究以探寻某些生物标志物与恶性胸腔积液的因果关系。Psallidas 等[19]研究了分泌型磷酸化蛋白1(SPP1)对恶性胸腔积液的影响，结果表明SPP1能引起巨噬细胞浸润到肿瘤、促进肿瘤血管生成，减少癌细胞在体内的凋亡，此外，它可以独立于血管内皮生长因子直接促进血管通透性增高。我们可以认为SPP1以1种协同的方式促进胸腔积液的积聚与肿瘤的播散，SPP1可能成为治疗干预恶性胸腔积液的一个有吸引力的靶标。载脂蛋白E(APOE)已被证明在非小细胞肺癌患者胸腔积液中明显升高，然而胸腔积液ApoE在NSCLC的诊断价值尚未得到很好的验证，因此有学者通过实验来评估其诊断价值，结果发现APOE在诊断NSCLC时灵敏度和特异性分别为70.8%和83.30%，证明胸腔积液中APOE浓度的增加是诊断以及鉴别诊断NSCLC的一个潜在标记[20]。血清降钙素原(S-PCT)作为全身性细菌感染的生物标志物被众所周知，然而近期有学者发现胸腔积液降钙素原(PF PCT)检测有助于鉴别结核性胸膜炎引起的胸腔积液和恶性胸腔积液[21]。最新发现[22]凝集素芯片可以用于确定肺癌患者的胸腔积液细胞蛋白谱，其中SNA有最高的敏感性(92.6%)、特异性(100%)和准确性(96.3%)，SNA可以作为生物标志物来鉴别反应性间皮细胞与腺癌细胞，从而证明凝集素芯片能够在胸腔积液中区分间皮细胞中的癌细胞。

2.2.3 其他胸腔积液相关因子检测 以胸腔积液为标本的检测越来越趋于多元化，除了细胞学检测、胸腔积液肿瘤标志物、生物标志物等检查外，许多新的项目受到广大学者及医务工作者的关注，这些项目虽然尚不成熟，但有望为恶性胸腔积液的诊断提供新的工具和思路。已有学者[23]证实染色体分析技术在恶性胸腔积液鉴别中具有灵敏度高、特异性强、成本低、易在基层医院推广的特点，对于临床上难以鉴别性质的胸腔积液患者，在进行细胞学检查的同时联合染色体分析可以大大提高恶性胸腔积液的检出率。有学者[24]为探究血清铁蛋白与胸腔积液铁蛋白检测对良恶性胸腔积液的诊断价值进行了临床研究，发现胸腔积液铁蛋白检测有助于良恶性胸腔积液的鉴别诊断，～ 而血清铁蛋白检测对良恶性胸腔积液的鉴别诊断价值不大。肿瘤血管生成在肿瘤的复发转移中起着重要的作用，研究发现[25]CD31、CD34、CD105 及VEGF 在非小细胞肺癌胸腔积液中的表达量明显高于增生和炎性胸腔积液表达，检测胸腔积液细胞中血管内皮标记物及血管内皮生长因子的表达水平可能对判断患者的预后有一定价值。表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的非小细胞肺癌患者对吉非替尼敏感，因此，EGFR突变检测在治疗决策中起着重要作用，最初这项检测主要涉及标准的肿瘤组织样本，近期细针穿刺所得和胸腔积液中的肿瘤细胞也可成功地为EGFR基因突变提供灵敏的检测素材，使EGFR基因突变的检测在临床中更为快速和普及[26]。

胸腔积液中肿瘤细胞的相关研究为恶性胸腔积液的诊断提供了新的方法和靶点，胸腔积液相关因子检测在临床诊断中亦具有很大的指导意义。

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