松材线虫病早期诊断技术研究评述

马 跃，吕 全，于成明,李 琴，刘会香*，张星耀 *

1．山东农业大学植物保护学院/山东省林业有害生物防控工程技术研究中心，山东 泰安 271018 2．国家林业局森林保护学重点实验室，中国林业科学院森林生态环境与保护研究所，北京 100091 3.山东新河矿业有限公司嘉祥林场，山东 嘉祥 272400

松材线虫病是以松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]为主导，通过松褐天牛等媒介昆虫传播的一种重大生物灾害。我国于1982年在南京中山陵首次发现该病，目前已扩散蔓延至全国16个省(市)，对我国现有松林资源、生态景观和林业经济造成了极大破坏和严重威胁。随着国际经济贸易往来的日益频繁，松材线虫病传播扩散的风险也在不断加大。虽然国内外学者已对松材线虫病进行了广泛研究，但该病害发生和防控形势依然严峻，发病早期不易诊断而无法及时采取措施以及感病松树难以治愈仍然是松材线虫病防治的难题。因此，加强对松材线虫病的监测预警，运用简单易行的早期诊断方法，及时发现疫情，彻底清除病死树，控制疫情扩散，是防治该病的重要手段。本文就国内外现行的松材线虫病早期诊断技术进行了总结评述，并对未来新技术的研究进行了展望。

1 现行早期诊断技术评述

1.1 林间症状诊断法

此法是依据感病植株在田间表现的典型症状来诊断病害。松树感染松材线虫病通常表现如下症状和规律：松树感病后针叶逐渐失绿，变黄，最后变为红褐色，倒挂枝上不脱落，远观似火烧状，针叶萎蔫是从基部开始，通常从局部发展到整体；发病树树干上通常能够观察到天牛产卵刻槽、蛀屑，嫩枝上可见松褐天牛补充营养的取食痕迹；树体流胶减少或停止；木质部往往有蓝变现象；感病树木通常是树冠浓密、树势健壮的优势木等[1]。

该方法适用于林间病害普查，适合熟悉当地林相及病虫害发生与危害情况的相关技术人员使用，需凭借丰富的经验来判断，主观性强，容易误诊或漏诊。该方法通常仅作为对松材线虫病的初步判断，与病原鉴定法结合应用，准确率高，实际应用普遍。

1.2 病原线虫鉴定法

对病害最可靠、最直接的诊断方法就是对其病原物的鉴定。在松材线虫病发病早期症状不易判断时，对疑似病死树取样的木材进行分离线虫并鉴定病原，是松材线虫病早期诊断的主要方法之一。

1.2.1 形态学鉴定法 松材线虫主要的形态学鉴别特征有：唇区高，溢缩明显；口针细，基部稍微膨大；中食道球椭圆形，占体宽的2/3以上；背食道腺开口于中食道球；排泄孔的位置大致和食道球与肠交接处平行；雌虫卵巢1个，阴门位于虫体中后部73%处，有阴门盖；雄虫交合刺大，弓形，喙突明显，交合刺远端膨大；热杀死后雌虫呈开阔“C”形，雄虫成“J”形。该法应用中最大难点在于区分与松材线虫同属的无致病力或致病力弱的拟松材线虫(B.mucronatus)。两者主要区别在于：松材线虫雌成虫尾部近圆柱形，尾端钝圆或有很短的尾尖突(不超过2 μm)，而拟松材线虫雌成虫尾部有较长的尾尖突(超过3.5 μm)；松材线虫雄成虫交合伞为卵圆形，而拟松材线虫雄成虫交合伞为板状，端部平截[2-3]。

形态学鉴定法操作简单易行，不需要复杂的仪器设备，一直是生产和研究上广泛采用的方法。但也存在一些不足：线虫形态特征不稳定，幼虫期很难鉴别，培养出成虫需要一定时间；砍取木材耗费人力物力且毁坏树木，浸泡分离线虫又耗时；要求分离操作过程要规范，镜检人员要有丰富经验。

1.2.2 生化检测法 蛋白质电泳检测法 根据线虫亲缘关系相近的种或种下类群的蛋白质分子量大小不同，通过PAGE电泳或琼脂糖凝胶电泳分离，根据凝胶上显示的蛋白质谱带的不同进行分类标记，即可鉴定松材线虫，由于蛋白质呈现的谱带包含所有可溶性蛋白，所提供的信息复杂，较难分析，限制了该法的应用[4]。

同工酶分析检测法 近30年来，国内外许多学者对松材线虫和拟松材线虫株系进行了同工酶差异的研究，筛选出酯酶、苹果酸脱氢酶、天冬氨酸转移酶、谷氨酸草酰乙酸转氨酶[5]等一些可将两者区分开来的酶。也有研究表明其特异性不明显，所需样本数量较大，蛋白质的表达影响因素较多，实际应用中存在一定局限性。目前为止，还没有哪种同工酶被公认为可以明确地区分松材线虫与拟松材线虫。

免疫学检测法 利用免疫学原理，白钢等[6]以疫木上分离的松材线虫的粉碎虫体免疫家兔制备抗血清，通过免疫印迹考察抗血清的特异性，利用固相松材线虫抗原和游离线虫抗原同线虫抗体相竞争，建立竞争型ELISA法用于松材线虫的分析，同时还利用抗松材线虫血清建立了在疫木切面上直接进行免疫组化染色检测松材线虫抗原的方法。曹宇等[7]用种子聚合法合成聚苯乙烯磁性微球，以兔抗松材线虫IgG致敏，制备出了能特异性地捕获松材线虫蛋白抗原的免疫磁性微球，用生物素标记抗体为示踪抗体，并结合酶标亲和素检测系统用于疫木样品的检测。该方法可直接捕获木屑中的微量线虫抗原，具有简便、快速、灵敏度高等优点。

纤维素酶扩散法 纤维素酶是一种与松材线虫病致病性相关的重要物质。Kojima等[8]将松材线虫分泌物进行电泳分析，发现松材线虫分泌的纤维素酶的谱带类型与拟松材线虫的不同。Kikuchi等[9]实验发现该纤维素酶产生于松材线虫的食道腺，并克隆出它的基因。蒋丽雅等[10]利用纤维素酶扩散法对线虫虫体提取液和分泌液进行了定性检测，结果表明松材线虫虫体内含纤维素酶并向体外分泌，而拟松材线虫等其它线虫几乎不含。张奇等[11]以松材线虫分泌的一种抗原性纤维素酶为指标建立了选择性抗体酶联免疫分析方法(SAEIA)，可简便、快捷地检测出疫木中存在的纤维素酶，具有较好的特异性。

以上几种松材线虫的生化检测技术具有特异性强、灵敏度高、方法简单、结果稳定、易于观察、耗时较短等优点，但是所用仪器设备较为复杂，技术要求相对较高，只适宜于在高等院校、出入境检疫检验机关等有条件的机构进行，不适宜于基层林业机构。

1.2.3 分子生物学检测法 分子生物学检测技术是通过分析线虫DNA特有的基因组区域而做出准确鉴定的方法。松材线虫的DNA较为稳定，找到它与其它线虫差异的DNA片段即可作为分子检测依据。相关的分子生物学检测技术主要包括探针技术以及基于PCR的各种检测技术，例如限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)、SCAR标记、PCR-RFLP、ITS-PCR、特异引物(PCR)、实时定量(Real-time PCR)、核酸杂交检测(Nucleotide hybridization)等技术，目前应用较多的是实时定量检测技术与SCAR标记检测技术，具有检测时间短、检测准确性高等优点[12-14]。松材线虫分子检测试剂盒的研发使用更为方便快捷。分子生物学检测技术克服了形态鉴定、生理生化检测方法存在的一些缺陷，精确度高，越来越广泛地被应用，但此类技术只适合于技术设备允许的实验室内应用。

1.3 流胶法

松树树脂分泌减少至停止是感染松材线虫病的早期症状之一，可作为早期诊断的依据。松树分泌树脂的能力可分为5个等级：一级流胶，树脂从孔口外流，且渗出量很多；二级流胶，树脂从孔口外流，且渗出量较多；三级流胶，树脂沉积在孔口下缘；四级流胶，树脂渗出在圆孔壁上，呈粒状；五级流胶，孔壁上无树脂流出。刘伟等[15]将三级流胶作为感病的标志，杨宝君等[16]研究了松树品种、接种量及线虫来源对流胶法的影响，进一步证明了流胶法作为松材线虫病树早期诊断的可靠性。

流胶法是最早应用于松材线虫病林间活立木早期诊断的方法，该法简单、易行、易辨认。由于影响松树流脂的其他因素较多，影响了该方法诊断结果的准确性，且松树一旦流胶停止后就很难挽救了，该法仅作为一种辅助诊断方法。

1.4 化学法

1.4.1 酸性品红追踪法 根据松树感染松材线虫病早期有挥发性物质渗漏入导管产生气穴而阻碍树液上升的现象，杨伟东等[17-18]采用酸性品红追踪树液流动的情况，根据茎干横切面着色情况判断是否有挥发性物质渗漏入导管，以此判断是否为松材线虫病。其它原因引起枯萎的松树并不会出现松脂渗漏现象，因此，该法可以在发病早期还未出现外观症状时诊断马尾松松材线虫病。该方法对松材线虫病的检疫防治和品种抗性鉴定研究均有重要意义，但该方法不便于操作，也不能用于林间活立木检测，其实用性还有待于深入研究。

1.4.2 pH指示剂法 王玉嬿、李海燕等[19-21]根据受害树木木材酸度增加的现象，研究出利用酸碱指示剂在松木上的颜色变化来快速检测松材线虫病方法。分别用0.04%的溴酚兰酒精溶液与0.04%二甲基黄酒精溶液对待检松树木盘或木屑进行染色，3～5 min后可观察到前者染色后健康木为紫罗兰色，而感病木颜色变为黄绿色或黄色，且松材线虫为害越严重黄色越明显，准确率可达85%以上；后者染色后健康木为黄色，而感病木变为红色，且松材线虫为害越严重红色越明显，准确率约60%。

此方法简单易行，可达到快速检测的目的，但两种指示剂均不能将松材线虫和天牛、拟松材线虫等为害的病死木区分，而且松木的pH值变化与多种因素有关，存在地域差异和树种差异，对不同树种、不同地区采用的指示剂及其显色的标准等有待深入研究。

1.4.3 显色法 王明旭等[22]的实验将显色剂加入木屑浸泡液中，感病木的显色由浅红色、红色直到深红色，且松材线虫含量越多颜色越深，而感染拟松材线虫的松材呈清白色或无色，健康木无色。该方法操作简便、稳定性好、准确性高、检测时间短，具有较好的发展前景，适用于生产一线监管的检疫检验人员。

1.5 电生理学方法

将声、光、电等多种原理应用到植物病害诊断技术中是一个很好的研究方向。傅和玉基于植物组织发生病变早期，细胞膜透性改变，电容值急剧缩小这一原理，综合生物学、电子学和传感技术研制出了便携式多种功能植物病害诊断仪[23]，并对林木枝干传染性病害腐烂病等和生理性病害低温灾害进行了试验验证，诊断准确率较高[24]。梁军等[25]对受松材线虫侵染与未受侵染的马尾松树体干部电容、电阻、单位电容和枯叶率等指标进行了测定，结果表明马尾松被松材线虫侵染后树体电容下降、电阻升高，差异显著。若以树体干部电容值0.50 nF为临界阈值，低于该值为受松材线虫侵染马尾松，高于该值为未受侵染马尾松，准确率可达89 %，可以依此诊断病害。

综合上述两人研究成果，依据松树感染松材线虫病后树体电容值下降的原理，改进植物病害诊断仪，将其应用到松材线虫病的早期诊断中，具有很高的研究价值。但是目前电指标测定方法和评价指标并不具备特异性，电指标出现异常只能说明树木树势受到了某一或某些因素的干扰，还需要结合树木外观症状、生理指标等其他方法综合确定具体的干扰因素。该方面技术的深入研究开发将对松材线虫病的早期无损诊断技术研究具有重要的科学意义和实用价值。

1.6 光谱学方法

王震等[26]对野外不同受害类型的马尾松进行了反射光谱测定，并对反射率曲线进行了分析，研究结果表明马尾松不同受害类型的光谱特征变化明显，且呈现出较好的光谱变化规律，即在绿光区(550 nm左右)和近红外区域(760 nm左右)，随发病程度的加深，反射率有明显的下降。这种变化规律对于在松材线虫入侵过程中，应用遥感技术研究森林资源的动态变化非常有价值，值得进一步研究并应用到实践中去。

杜华强等[27]对野外疑似松材线虫的马尾松进行反射光谱连续测量，在对反射光谱数据红边位置、绿峰反射高度和红谷吸收深度分析的基础上，进一步利用分形理论计算450～780 nm之间的反射光谱曲线的分形维数，可作为马尾松健康状况预测的指标。分形理论在松材线虫病早期预测中具有一定的潜力，相关研究还有待进一步深入。

1.7 早期检测管法

潘沧桑[28]发明了一种早期检测管用于松材线虫病的早期诊断，即将带有生物活性物质的

检测管插到树上，几天后通过检测管壁即可知该株松树是否有松材线虫。中科院动物研究所赵莉蔺等人[29]在早期检测管的基础上研发了松材线虫化学信息取样技术，即在松材线虫不同的生活周期，检测管内加入不同的化学信息物质对树体内松材线虫进行引诱，再通过镜检形态鉴定或其他线虫鉴定方法鉴定病原，还对不同发病时期松树上取样部位进行了实验研究。

该方法既实现了松材线虫病早期诊断，又可使松树免于削皮砍伐之患，达到保护松林生态景观的目的。此外，该法操作简便，准确率高，不必带大量样品回室内检测，减轻了检疫检验人员的工作，可以满足森林防疫机构的需要，适用于野外大规模病害诊断及普查监测，具有广阔的应用前景。

1.8 其它方法

1.8.1 松枝解剖法 来燕学[30]将便携式显微镜与松枝解剖技术结合应用，实现了对松材线虫病的快速诊断。即剪取松枝后用解剖刀进行松枝切片，再用便携式显微镜镜检。用该法在林内鉴定一个样本平均耗时2.5 min，方法简单效率高，但取样和测样过程具主观性，存在漏诊或无法诊断等弊端，有待进一步验证改进。

1.8.2 松褐天牛引诱辅助诊断法 松材线虫主要依靠松褐天牛携带传播，采用林间挂设松褐天牛诱捕器或设立诱木引诱松褐天牛，进而分离其成虫体内携带的松材线虫或由松褐天牛携带到诱木上的松材线虫，并镜检鉴定线虫的种类，可辅助诊断松材线虫病[31]。蒋丽雅等[32]通过林间设置松褐天牛引诱剂装置，对引诱到的松褐天牛分离其体内线虫并镜检，10min后就能判定有无松材线虫存在。

该方法操作相对简单易行，尤其在松褐天牛羽化的高峰期，检测效率较高。实际应用中在林间症状诊断的基础上，再结合病、死树体内线虫分离鉴定法或松褐天牛引诱辅助诊断法，可以取长补短，提高诊断的准确率。

2 展望

松材线虫病早期诊断技术研究是实现这一重大生物灾害早期预警的综合防控关键技术手段之一。目前很多诊断方法或受条件或受技术的限制而不完善，尚需继续探索和研究。未来松材线虫病早期诊断技术应向更为简单易行、快速、精确、无损、高效、适用于林间活立木等方向发展。

松材线虫病早期诊断实用技术的研究创新可以尝试从以下几个方面突破：pH指示剂法方便快捷，可通过进一步实验研究制定变色标准；研制便携式仪器用于野外活立木诊断；将纳米检测手段应用到松材线虫病早期诊断技术研究中；研究松材线虫分泌的纤维素酶的特异性，并将其作为松材线虫病诊断的特异性信号应用，还有其它一些检测信号在感病树体中的分布和捕获都将是未来的研究重点；应用电学，光谱学等物理学原理进行松材线虫病早期无损诊断技术研究也是一个重要的研究方向，已有研究成果为松材线虫病早期诊断仪器的研制提供了重要的实验数据和技术支撑，还有待于深入研究其特异性及实用性。

松材线虫病早期诊断技术的不断完善创新对更好地诊断该病害的发生，从源头控制病原，防止疫情扩散，保护森林生态环境，具有重大的经济、生态与社会意义。通过深入研究改进现有方法及多学科相互渗透，松材线虫病的早期诊断技术将会取得突破性进展。

[1] 万方浩,郑小波,郭建英.重要农林外来入侵物种的生物学与控制[M].北京:科学出版社,2005:573-616

[2] Fukushige H, Futai K. Characteristics of eggs shell and the morphology of female tail-tips of Bursaphelenchus xylophilus, B. lignicolus and some strains of related species from France[J]. Jpn. J. Nemat, 1985, 15: 49-54

[3] Kishi Y. The ping wood nematode and Japanese pine sawyer [M]. Tokyo, Japan：Thomas Co.，Ltd，1995: 302

[4] 张 锴,梁 军,张星耀.中国松萎蔫病病原线虫鉴定及诊断技术研究[J].中国森林病虫,2011,29(6):31-34

[5] 胡凯基,杨宝君.松材线虫和拟松材线虫不同株系酶电泳的研究[J].林业科学研究,1995,8(1):73-77

[6] 白 钢,王玉嬿,马洪周,等.疫木中松材线虫的免疫学检测方法的研究[J].林业科学,2005,41(2):91-95

[7] 曹 宇,李海燕,马洪周,等.免疫磁性捕获ELISA技术在松材线虫检测中的应用[J].林业科学研究,2005,18(5):585-589

[8] Kojima K, Kamijyo A, Masumori M. Cellulase activities of pine wood nematode isolates with different virulences [J]. Jpn For Soc, 1994, 76: 258-262

[9] Kikuchi T, Jones JT, Aikawa T, et al. A family of glycosyl hydrolase family 45 cellulase from the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus[J]. FEBS Letters, 2004, 572: 201-220

[10] 蒋丽雅,王晓芸.松材线虫提取液和分泌液中纤维素酶定性检测[J].森林病虫通讯,1995(3):9-12

[11] 张 奇,马洪周,杨文博,等.松材线虫纤维素酶的分离纯化及免疫学检测方法的研究[J].南开大学学报(自然科学版),2006,39(1):95-99

[12] 汤 坚,陈凤毛,叶建仁,等.松材线虫分子检测技术研究进展[J].林业科技开发,2008,22(5):5-9

[13] 王 焱,季 镭,余本渊,等.3种松材线虫分子检测技术的比较分析[J].南京林业大学学报,2007,31(4):128-132

[14] 陈凤毛,叶建仁,吴小芹,等.松材线虫两种实用分子检测技术[J].北京林业大学学报,2011,33(4):149-152

[15] 刘 伟,杨宝君,徐福元,等.松材线虫病早期诊断的研究-Ⅰ马尾松、黑松松材线虫病树的早期诊断[J].林业科学研究,1998,11(5):455-460

[16] 杨宝君,刘 伟,徐福元,等.松材线虫病早期诊断的研究-Ⅱ松树品种、接种量及线虫来源对流胶法的影响[J].林业科学研究,1999,12(3):251-255

[17] 杨伟东,蔡思鸣,邓晓峰.松材线虫对马尾松的致病性及其早期诊断试验[J].植物检疫,1993,7(3):177-181

[18] Yang W D. Obserration on early response of Pinus massoniana infected by Bursaphelenchus xylophilus[C]. In: Inernational symposium on pine wilt disease caused by pine wood nematode. Beijing: Forestry press in China,1995

[19] 王玉嬿,宋玉双,臧秀强,等.两种指示剂对松材线虫病病木的测试[J].植物病理学报,1996,26(4):371-376

[20] 王玉嬿.南京地区黑松、马尾松松材线虫病病、健木pH值的比较[J].云南农业大学学报,1999,14(增刊):98-102

[21] 王玉嬿,李海燕,舒朝然,等.几种松树松材线虫病木和健木pH值差异的研究[J].植物病理学报,2001,31(4(4):342-348

[22] 王明旭,张志飞,罗 宽,等.松材线虫快速检测技术方法的比较研究[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2004,30(3):239-242

[23] 傅和玉.植物病害诊断仪的传感机理研究[J].北京教育学院学报,2000,14(2):43-48

[24] 傅和玉.林木病害早期诊断技术的研究[J].北京教育学院学报,2006,1(1):30-34

[25] 梁 军,屈智巍,刘惠文,等.杨树溃疡病及松材线虫病对树体干部电指标的影响[J].林业科学,2006,42(12):68-72

[26] 王 震,张晓丽,安树杰.松材线虫病危害的马尾松林木光谱特征分析[J].遥感技术与应用,2007,22(3):367-370

[27] 杜华强,葛宏立,范文义,等.分形理论在马尾松松材线虫病发病早期高光谱探测中的应用[J].林业科学,2009,45(6):68-76

[28] 潘沧桑.松材线虫病的早期诊断检测方法[P].中国: CN1167806C,2002

[29] Lilin Zhao, Ping Jiang. Within-tree distribution and attractant sampling of propagative pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus: An early diagnosis approach[J]. Forest Ecology and Management, 2009, 258: 1932-1937

[30] 来燕学.用松枝解剖法快速检测松材线虫病原[J].浙江林学院学报,2005,22(2):188-192

[31] 范军祥,黄焕华.松材线虫病的诊断方法探讨[J].广东林业科技,2008,24(5):52-55

[32] 蒋丽雅,周健生.引诱松褐天牛检测松材线虫病的方法[J].森林病虫通讯,1997(3):41-43