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K-RAS和DCC在直结肠癌中的表达及意义

2014-04-02张阿伟范贵民扈清云

黑龙江医药科学 2014年2期
关键词:癌基因多肽外显子

熊 慧,张阿伟,范贵民,扈清云

(佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯154007)

直结肠癌的发生经历了一系列组织学变化的过程,每一个阶段都伴随着特定的遗传变异。一般来说,直结肠肿瘤的形成需要两个必要条件,一是存在一个适合早期突变细胞无限克隆扩增的环境,二是肿瘤相关基因的不稳定性。KRAS基因突变的常见方式为点突变,突变位点好发于1号外显子的第12位、第13位密码子上,其突变型可为半胱氨酸、缬氨酸、精氨酸,突变的发生导致编码的氨基酸序列发生改变,从而编码出致癌蛋白p21,p21蛋白能够刺激细胞生长、发育和增殖,进而诱发细胞癌变,已有研究表明p21蛋白诱发直结肠癌。DCC基因编码的DCC蛋白主要由胞内多肽和胞外多肽两部分组成,胞外多肽的氨基酸顺序与神经细胞黏附因子(neural cell adhesion molecule,NCAM)极其相似,当抑癌基因DCC缺失,不能编码DCC蛋白之后,细胞生长及分化发生障碍,此时细胞即可发生恶变。本研究采用免疫组织化学法,我们将同步检测68例直结肠癌中癌基因KRAS和抑癌基因DCC的表达情况,以期找到它们之间的相关性,为直结肠癌的早期无创或微创性诊断提供一定的理论依据。K-RAS和DCC表达是否与肿瘤组织分型、浸润转移相关,是否可作为判断直结肠癌生物学行为的一个指标,从而为直结肠癌的诊断和治疗提供新的生物学标记和肿瘤基因治疗的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

收集佳木斯大学附属第一医院2011~2013年手术切除的直结肠癌组织标本68例,直肠癌标本中男44例,女24例,31~80岁,平均58.5岁。良性病变组织标本45例,均为明确诊断病例,组织样本及时用10%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,制片厚4~5μm,进行免疫组织化学染色。

1.2 主要试剂

K-RAS、DCC兔来源多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司,采用该公司SP系列免疫组化试剂盒检测。

1.3 实验方法

石蜡切片常规脱蜡至水,采用SP试剂盒法,按说明步骤处理,一抗分别为K-RAS、DCC兔来源多克隆抗体,工作浓度为1:200,滴加后4℃冰箱孵育过夜,DAB显色,苏木素复染,脱水,中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗。

1.4 结果判定

K-RAS阳性细胞分步弥散,染色位于包膜和胞质;DCC蛋白阳性染色主要位于细胞质内,以上染色均呈棕黄色细颗粒状。判断标准:显微镜镜下(×100)5个视野中平均阳性细胞所占比例,>10%的癌细胞胞质中或包膜呈棕黄色,浅黄色者定为弱阳性,计入阳性[1]。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,各组数据采用χ2检验。

2 结果

2.1 K-RAS在直结肠癌中及良性病变组织的表达

68例直结肠癌病例中,K-RAS表达阳性42例,阳性率为61.8%,其中肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移情况及组织学类型的表达率差异不显著,45例良性病变组织中,KRAS表达阳性14例,阳性率为31.1%。直结肠癌组与良性病变组比较差异极显著(P<0.01)。

2.2 DCC在良性病变组织及直结肠癌中的表达

68例直结肠癌病例中,DCC表达阳性5例,阳性率为7.4%,45例良性病变组织中,DCC表达阳性41例,阳性率为91.1%。直结肠癌病例中,不同临床病理特征表达阳性率差异不显著。直结肠癌组与良性病变组比较差异极显著(P <0.01)。

3 讨论

Ras基因在人类的第12号染色体发现,在5'端包含4个编码区外显子和1个非编码区外显子,能够编码含189个氨基酸组成的ras蛋白,其相对分子量为21×103,故命名为p21蛋白。K-RAS基因突变的常见方式为点突变,突变位点好发于1号外显子的第12位、第13位密码子上,其突变型可为半胱氨酸、缬氨酸、精氨酸,突变的发生导致编码的氨基酸序列发生改变,从而编码出致癌蛋白p21,p21蛋白能够刺激细胞生长、发育和增殖,进而诱发细胞癌变[2],K-RAS的基因突变时,鸟苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase,GTPase)活性降低,p21蛋白GTP结合牢固,不易被GTPase水解,p21蛋白长期处于激活状态,进而持续刺激细胞生长、发育和增殖,最终诱发大肠癌[3]。在非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)患者中发现RAS基因的扩增[4],研究表明,K-RAS基因过表达明显降低自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)对肿瘤的杀伤作用,可作为大肠癌转移,病情恶化的特征[5]。本研究中,K-RAS在直结肠癌组织中高表达,对于直结肠癌的临床诊断有一定的意义,因此,我们认为,如果在直结肠病变组织中检测K-RAS蛋白,则有利于直结肠癌的早期诊断,进一步研究未发现其表达与直结肠癌临床病理特征的相关性,这与已有研究报道一致[6]。

DCC基因位于18号染色体,基因全长1400kb,包含29个外显子,能够编码含1447个氨基酸的跨膜蛋白,DCC基因编码的DCC蛋白主要由胞内多肽和胞外多肽两部分组成,胞外多肽的氨基酸顺序与神经细胞粘附因子(neural cell adhesion molecule,NCAM)极其相似,当抑癌基因DCC缺失,不能编码DCC蛋白之后,细胞生长及分化发生障碍,此时细胞即可发生恶变[4]。研究表明,DCC基因失活与直结肠癌的浸润程度及转移呈正相关[9],本研究中,DCC蛋白在直结肠癌中缺失率为92.6%,DCC的编码产物与黏附分子具有同源性,它的缺失应该会增加肿瘤细胞的侵袭力,但我们未发现其表达与肿瘤的侵袭转移能力有关,其相关性还有待于进一步研究揭示。相应DCC蛋白的缺失率明显增加,我们认为这对于研究直结肠癌的演变及进展具有重要意义。尽管目前对K-RAS和DCC基因的研究有了很大的进步,但是关于K-RAS和DCC基因的失活机制、K-RAS和DCC蛋白的功能、K-RAS和DCC基因与其它基因是如何协同作用与直结肠癌的发生、发展过程中K-RAS和DCC基因诱导细胞分化的机制尚未完全清楚。K-RAS基因失活的同时DCC蛋白表达缺失是否能够用于指导临床早期诊断,是否关系直结肠癌肿瘤组织病理分型、肿瘤分期仍待于进一步探究。肿瘤发生可能是癌基因突变和抑癌基因失活共同作用的结果,目前尚无报道联合检测K-RAS和DCC表达情况,我们发现在直肠癌组织中,K-RAS呈高表达,DCC则呈缺失表达,从而我们认为以上两种因素的协同调控直结肠癌的发生,K-RAS基因突变和DCC基因表达缺失与直结肠癌的发生关系密切,能够在分子水平判断直结肠癌生物学行为。这为直结肠癌的诊断和治疗提供新的生物学标记和肿瘤基因治疗的靶点。

[1]仇容,陈增良,司马军,等.DCC、P53及VEGF在结直肠腺癌癌组织中的表达[J].基础医学与临床,2005,8

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