利用细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ分析青海藏区细粒棘球绦虫系统发育学

曹得萍，樊海宁，毋德芳，赵海龙，白海燕

包虫病(Echinococcosis)是细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus) 和多房棘球绦虫(Echinococcmultilocularis)的幼虫寄生于人及食草的家畜类及啮齿类动物等宿主体内所致的一种严重的人兽共患寄生虫疾病，我国西北广大牧区是包虫病的主要流行区，是西部地区人群因病致贫、因病返贫的主要原因。青海高原是世界罕见的棘球蚴病(包虫病)高发流行区，1995-2005年青海省棘球蚴病流行病学调查结果表明[1]，青海省棘球蚴病区遍布全省各地，人群棘球蚴病患病率在0.18%～8.23%之间，平均患病率为3.28%。

棘球绦虫不同种及亚种有不同的流行病学特征，其致病性也存在较大差异，其分类学研究必须在掌握多项指标的情况下重新鉴定新种和虫株，以揭示其生物学、遗传学和生理学特征，了解不同地域和不同宿主的变异特点。这不仅促进寄生虫分类学的进展，而且对我们认识棘球绦虫和棘球蚴病的流行病学及找出合理的预防措施有重要意义[2]。线粒体DNA(mtDNA)基因常被应用于分类和系统发生研究，线粒体DNA测序法也被用于检测棘球绦虫属的遗传变异。本文利用细胞色素氧化酶亚单位 Ⅰ (COX Ⅰ )分子标记对收集到的59份流行于青海省棘球蚴样本和网上下载的13条棘球绦虫细胞色素氧化酶 Ⅰ 进行系统发育学探讨和分析。

1 材料和方法

1.1样本来源 本研究中59份棘球蚴标本(35份来自青海省西宁市各大医院包虫病手术标本；24份绵羊包虫病标本来青海省个屠宰场和西宁市冷库)。

1.2基因组DNA抽提和PCR扩增、测序 利用天根细胞组织提取基因组试剂盒按说明书逐步提取棘球蚴基因组DNA,提取的基因组DNA用于细胞色素氧化酶亚单位 Ⅰ (COX Ⅰ )基因扩增，引物序列[3]F5-TATTGGAGATTATGGAGCTG-3，R：5′-AAAGCGGGCGCGCGGTGCTG-3′，PCR产物送上海生工生物公司测序。

1.3COX Ⅰ基因序列比对分析 本研究涉及72条序列，其中59条序列是青海省不同地区人体级绵羊分离株的序列，其余13条序列从GenBank下载(见表1)。所有细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ(COX Ⅰ )序列均采用Clustal X (Thompson et al. 1997)[4]进行比对，比对时采用默认参数。在PAUP*4.0B10(Swofford, 2002)[5]中对每个序列的碱基组成和序列变异情况，并对序列所有位点碱基组成稳定性进行卡方统计检验(chi-square tests:χ2)。运用SeqVis v.1.3 (Ho et al. 2006)[6]软件进行序列异质性检验，使用软件DAMBE (Xia and Xie, 2001)[7]对COX Ⅰ序列进行单倍型分析，使用Modeltest 3.7 (Posada and Crandall, 1998)[8]程序依据AIC (Akaike information criterium; Alaike, 1974 ) 和PAUP软件选择NJ和Bayesian分析的核苷酸进化最适模型。由Mrbayes-3.1.2 (Ronquist and Huelsenbeck, 2003)[9]软件来进行Bayesian分析。

表1 来自GenBank12株棘球绦虫虫株来源、数据库登录号信息表

2 结 果

2.1碱基组成和饱和检验 本研究共72条COX Ⅰ序列用于系统发生关系的分析研究。利用SeqVis (Hoetal., 2006) 程序进行所有序列异质性分析，得到序列的异质性好，故所有序列将用于系统发育分析(图1)。在869个位点中，375个可变为点，245个简约信息位点。用于分析的序列长度在654 bp (CH2) 至850 bp(网上下载13条序列)。4个碱基频率是：A=0.16，C=0.107，G=0.245和T=0.488(各碱基总和为1)，棘球绦虫COX Ⅰ基因碱基组成A+T 略大于C+G。所有序列的转换和颠换比的平均似然估算值为25.559。所有样本的全部编码位点的碱基频率具有同质性(χ2=59.53，df =213，P=1.00)(图3)。应用DAMBE软件进行单倍型分析，从72条序列挑出71个单倍型。平均遗传距离为0.054，猪带绦虫(AB086256)和人体包虫病样本13(CH13)之间遗传距离最大是0.437。

图1利用SeqVis(Hoetal.,2006)程序得到的细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ(COXⅠ)基因数据四面体点图

Fig.1TetrahedralplotsforCOXⅠgenedataset,whichwereobtainedusingtheSelectSitescommandfromtheViewMenuintheprogramSeqVis(Hoetal,2006)

2.2系统发育分析 比对好的序列(72条序列：本实验测序59条中国株，13条外国株自网上下载)应用于系统发育分析。不同方法构建的拓扑树基本上是相似的，采用临接法和贝叶斯法构建Bayesian树(图3)得到一致树在多数节点上有很高的后验概率(posterior probablities, PP)。聚类分析的结果是，采集的标本除了ZH4、CH15和CH13与AB018440(多房棘球绦虫)聚在一枝(PP=1.00)，其余56株虫体与AB297617(细粒棘球绦虫G1株)聚在一枝(PP=1.00)。而在流行于青海省的这些细粒棘球绦虫虫株之间又形成姐妹枝(PP>0.60)。AB297617(G1)和AB732958(非洲狮子株)邻接，说明这两虫株之间的遗传距离近。G6、G7、G8、G10四株聚在一枝与E.ortleppi(AB235846)形成姐妹枝。

3 讨 论

线粒体DNA(mtDNA)结构简单、稳定、以母系方式遗传, 核苷酸歧异度大、进化速度快，这就使得线粒体DNA在种内、种间、群体间和群体内具有广泛的多态性，可以作为一个可靠的遗传标记，广泛应用于寄生虫的种类鉴定中[10]。

本研究在前人[11-12]研究的基础上开展了流行于青海高原地区棘球绦虫基因多态性及系统发育关系的探讨。本研究对收集到的59份包虫病样本(35份来自病人肝脏或肺脏，24份来自绵羊肝脏或肺脏)，结果显示在我省主要流行的棘球绦虫虫株主要以细粒棘球绦虫G1型和多房棘球绦虫为主，细粒棘球绦虫G1型为普通绵羊株。我们采集到的标本主要都归属于细粒棘球绦虫G1型，但它们的基因型各不相同，在N-J树和贝叶斯树中均形成梳齿状的支序关系，这就说明流行于青海省的细粒棘球绦虫中有众多的细粒棘球绦虫G1型亚型存在。

图2贝叶斯MrBayesv.3.1.2分析COXⅠ基因数据得到的50%多数一致树，节点树字代表贝叶斯后验概率

(CH/ZH代表棘球蚴来自人体；SH/SP代表棘球蚴来自绵羊肝脏和肺脏)

Fig.2The50%majority-ruleconsensustreeinferredfromBayesianinferenceofcytochromeoxydaseenzymeⅠ(COXⅠ)genedatasetbyusingMrBayesv.3.1.2

Numbers at nodes represent Bayesian posterior probabilities. (CH/ZH: human samples; SH/SP: sheep's liver or sheep's lung samples)

青南高原有其独特的地理景观和生态条件，这里动物资源十分丰富，人和动物棘球蚴的感染十分严重，在寄生虫长期繁衍演化的过程中，很可能发生细粒棘球绦虫的种内变异，产生不同的虫株。王虎[1]等研究显示，在青海不同地理区域均存在人与动物的囊型棘球蚴病和泡型棘球蚴病、细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的流行与感染，表明青海省是囊型和泡型棘球蚴病的混合流行区，但以囊型棘球蚴病/细粒棘球绦虫为主。本研究的最大遗憾是收集包虫病标本的中间动物宿主的种类较少，故在本次分析中没有出现石渠细粒棘球绦虫虫株出现。我国青藏高原发现的石渠棘球绦虫(E.shiquicus)则分别需要藏狐和高原鼠兔作为终末宿主和中间宿主，到目前为止，未发现人体和犬感染石渠棘球绦虫的证据[14]。由于棘球绦虫的终寄主和中间寄主较多，有很多问题仍然缺乏完整、 有说服力的证据，其种株分析鉴定今后仍是一个较为复杂的课题。

总之，本研究表明青海高原细粒棘球绦虫以G1型为主，各细粒棘球绦虫细胞色素氧化酶Ⅰ基因型存在众多多样性，可能是由于本地方居住人群的特殊生活方式及地理环境造成的。青海省细粒棘球绦虫基因多样性也给本地区包虫病的预防控制带来巨大的困难。故研究本地区棘球绦虫基因多样性和各虫株之间的系统发育学关系为包虫病的有效预防控制奠定良好的基础。

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