上皮间质转化和内皮间质转化在肾纤维化中的研究进展

金 芬，张忠寿，黄卫锋

(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)

上皮间质转化和内皮间质转化在肾纤维化中的研究进展

金 芬，张忠寿，黄卫锋

(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)

上皮间质转化(EMT)和内皮间质转化(EndMT)参与各种纤维化疾病的发病机制，EMT和EndMT已经成为器官纤维化研究的一个重点课题。EMT和EndMT在肾的纤维化过程中起到至关重要的作用。越来越多细胞内外分子可控制EMT和EndMT的表达，尤其是microRNA(miRNA)在EMT和EndMT中的调控作用，已被确定可利用于开发治疗纤维化。本文综述了EMT和EndMT在肾纤维化中的研究进展，了解EMT和EndMT参与肾病纤维化过程的机制，这将会给人类肾纤维化疾病的治疗提供一种新的靶点和方法。

上皮间质转化；内皮间质转化；肾的纤维化；miRNA

肾纤维化是肾长期损伤或正常伤口愈合过程中功能失调，导致过量的细胞外基质(ECM)沉积造成的。EMT与EndMT过程中激活产生的成纤维细胞是肾成纤维细胞的主要来源。在肾纤维化过程中，肾成纤维细胞发挥着重要的作用。在EMT和EndMT过程中存在复杂的调控，最新的研究表明，miRNA在EMT和EndMT过程中发挥重要的调节作用。miRNA是小的非编码RNA，通过抑制蛋白质翻译或诱导mRNA降解来抑制靶基因的表达。miRNA可调控细胞的分化、增殖、死亡、代谢等多种病理生理机制的基本过程[1]。因此，研究EMT和EndMT过程在纤维化中的作用，可以推进我们对常见发病机制的理解，也可能为治疗干预提供新的靶点。这篇综述侧重于上皮间质转化和内皮间质转化在肾脏疾病中的生物学角色。

1 EMT在肾纤维化中的作用

在上皮-间质转化过程中上皮细胞有一系列的变化，它的极性丧失，迁移和运动能力增强，同时获得间质细胞特性。EMT在细胞运动和发育过程中可促进新组织的产生，但也是多种疾病的发病机制之一。上皮细胞是位于皮肤或腔道表层的细胞，它们与相邻的细胞存在着紧密的细胞连接，从而抑制上皮细胞潜在的运动和分离。与此相反，间充质细胞不形成规则的细胞层。间充质细胞相对于上皮细胞其形状较长，呈现极性，迁移能力较强。间充质细胞与邻近细胞的相互作用可能影响间充质细胞的极性，但是它们缺乏典型的上皮细胞顶-底极性。此外，在组织内间充质细胞容易单独迁移。间充质细胞的发生发展对于个体的发育至关重要，他们能够在胚胎中长距离的迁移，并进一步形成一个特定器官。在成人体内，成纤维细胞是由胚胎时期间充质细胞分化而成的，它的主要功能是分泌细胞外基质来保持结构完整性。Kalluri等[2]将EMT分为以下三种类型：第一种类型的主要生物学功能是通过间充质细胞上皮化(MET)过程产生上皮细胞，与胚胎植入、发育和器官形成相关。这种类型EMTs既不引起纤维化，也不诱导侵袭；第二种类型的EMT是上皮细胞转化成组织成纤维细胞，与组织的损伤修复、组织再生和器官纤维化相关。与第一种类型的EMT相比，炎症反应诱导第二种类型的EMT发生，但当炎症反应消失或缓解后，该类型的EMT即自行停止，尤其是在创伤愈合和组织再生中[3]。在器官纤维化过程中，持续的炎症反应导致第二种类型的EMT持续进行，并最终造成器官纤维化[3]；第三种类型的EMT是指与上皮细胞恶性肿瘤相关的上皮-间质转化过程。原发性上皮组织肿瘤细胞通过第三种类型EMT形成具有迁移能力的间充质细胞，随血液流动转移至不同部位，进而通过MET过程形成上皮细胞的肿瘤转移灶[4]。

成纤维细胞特异蛋白(Fibroblast-specific proteinl，FSP-1)、S100类细胞骨架蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白是各种器官纤维化过程中EMT的可靠标志物[2]。以上这些标记物，连同盘状结构域受体酪氨酸激酶2 (Discoidin domain receptor tyrosine kinase 2，DDR2)、波形蛋白和结蛋白，在肾、肝、肺、肠等器官中，已被用于识别慢性炎症诱导的EMT过程中的上皮细胞。有些细胞既表现出形态学方面的上皮特异性和分子标志物，如角蛋白和上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)，同时又伴随FSP-1和α-SMA等间充质细胞的标记，这一现象则表示这类细胞有可能处于EMT的中间阶段。种种迹象表明，炎症反应诱导的上皮细胞EMT过程，使上皮细胞进行了不同程度的上皮-间质转化。最终，这些细胞离开上皮细胞层，穿过底层基底膜，堆积在间质组织中，摆脱所有的上皮标记，并获得完全的成纤维细胞表型。

炎性损伤的小鼠肾脏可以引起一系列的炎症细胞聚集和入侵，炎症细胞通过释放细胞因子，如：转化生长因子(TGF-β)、血小板衍生因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)等，诱发肾脏上皮细胞发生EMT[2]。炎症细胞中巨噬细胞和被激活的成纤维细胞起最主要的作用，它们聚集在损伤部位释放出这些生长因子。此外，这些细胞还释放趋化因子和基质金属蛋白酶(MMP)，特别是MMP-2、MMP-3和MMP-9[5]。TGF-β在器官纤维化过程中诱导EMT的意义已被广泛研究。在小鼠的肾、肝、肺、肠纤维化模型中，骨形态发生蛋白7 (BMP-7)是TGF-β的拮抗剂[6]，它可以逆转TGF-β诱导的E-cadherin蛋白丢失。BMP-7通过活化素受体样激酶2(Activin like kinase-2/-3/-6，ALK-2/3/6)和下游转录因子Smad蛋白，恢复E-cadherin蛋白的表达[6]。在严重纤维化的小鼠中重新表达BMP-7可以逆转EMT和修复受损的肾上皮结构，BMP-7的作用通过MET来起作用的。BMP-7在逆转EMT的同时还伴随器官功能的恢复，FSP-1+与α-SMA+阳性标志着间质成纤维细胞的减少以及BMP-7信号通路的重新激活[6]。不同类型的EMT及EMT过程中的不同阶段可能由一组共同的刺激、信号转导途径、转录因子、转录后调节，诱发和调节[3]。

2 miRNA在EMT中的调节作用

miRNA的全基因组分析表明，miR-200、miR-205与EMT高度相关，miR-200与众多细胞系及上皮组织E-cadherin蛋白的表达有很大关系[7-8]。miR-200与锌指E盒结合同源蛋白1(ZEB1)和Smad相互作用蛋白1(SIP1)的3'非编码RNA结合，抑制ZEB1和SIP1的表达，从而提高E-cadherin的蛋白表达，增强上皮细胞的表型。miR-200家族及其他miRNAs与EMT有关的下游靶点已经确定，miR-141能够抑制TGF-β2[8]，miR-200a可以抑制β-链蛋白(β-Catenin)[9]。miRNAs与TGF-β的信号通路也存在紧密的联系。在TGF-β诱导EMT的乳腺上皮细胞中，smad4介导的转录可以激活miR-155的表达，miR-155使上皮细胞失去极性的同时影响上皮细胞间的紧密连接[10-11]。表达miR-155的上皮细胞对TGF-β的应答更为迅速。RhoA是miR-155下游的一个关键靶基因，它在细胞连接的形成和稳定中起主要作用。RhoA mRNA中有三个与miR-155结合的保守位点，它们可能是miR-155的结合调控位点[10]。这些研究表明，除了TGF-β介导的泛素化降解RhoA外，miR-155在EMT的过程也会起到进一步抑制RhoA的作用。在TGF-β诱导EMT的乳腺上皮细胞中，miR-29a和miR-21的表达水平上升[10]，但它们在EMT中的作用尚未完全阐明。过表达miR-29会诱导细胞发生EMT，抑制锌指同源蛋白36(Zinc finger protein 36 homolog，ZFP36)，激活Ras信号通路[11]。miR-21在各种肿瘤中高表达，并可通过诱导癌细胞的EMT而使癌细胞转移。miR-21的启动子区域存在有典型的E-box结合原件。E-box结合原件作为ZEB1的结合位点，结合ZEB1后诱导miR-21转录同时解除BMP-6对乳腺癌细胞EMT的抑制作用[13]。另外有研究表明，miR-9直接作用于E-cadherin蛋白的mRNA编码区[12]。miR-9的表达异常会诱导乳腺上皮细胞EMT的发生[13]。

3 EndMT在肾纤维化中的作用

血管内皮细胞与上皮细胞有一些共同的性质，它也可以通过类似EMT的表型过渡产生成纤维细胞，这一过程称为内皮间质细胞转化(EndMT)[14]。内皮细胞排列在整个循环系统和淋巴系统中，形成内衬血管和淋巴管。这些细胞在解剖学上与鳞状上皮类似，表达出上皮细胞的顶-底极性同时又以粘合连接和紧密连接的方式紧密连接在一起[15]。这些细胞表达不同的生物标志，如：VE-cadherin、CD31和细胞角蛋白。在EndMT过程中与EMT类似，内皮细胞失去了附着力以及上皮细胞顶-底极性，形成了具有高度侵袭力、迁徙力、梭形细长的间充质细胞。随着细胞极性和形态的变化，细胞内的生化状态也随之改变，失去内皮细胞特异性标志物CD31和VE-钙粘蛋白，获得间质细胞特异性标志物α-SMA和FSP1[15]。

Zeisberg等[16]在2008年运用三种小鼠模型，在单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction)、链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病、COL4A3(α3 chain of collagen type 4)基因敲除的小鼠模型中进行了具有里程碑意义的实验。该实验证实了EndMT在肾脏纤维化中的作用，他们在三种小鼠模型中发现有肌纤维母细胞表达内皮标记物CD31和血小板内皮细胞粘附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1)，同时也表达成纤维细胞标记物α-SMA和FSP-1。此外，在6个月内单次注射链脲佐菌素后诱导的CD1小鼠肾脏模型中，它的肾脏表现出渐进性肾小球硬化和肾小管间质纤维化。采用双免疫标记实验显示，约40%的FSP-1(+)和50%的α-SMA(+)肾脏间质细胞显示出CD31+[16]。在22周龄COL4A3基因敲除小鼠的肾脏中约有45%的α-SMA(+)和60%的FSP-1(+)的成纤维细胞呈现CD31+。这些现象表明这些成纤维细胞可能是内皮细胞的起源，EndMT可能会在肾脏纤维化的过程中促进成纤维细胞的积累[16]。Li等[17]在2009年也证实了EndMT在早期糖尿病肾病中可以促进肌纤维母细胞的产生。利用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的转基因小鼠，他们发现在STZ诱导的糖尿病肾病小鼠中有大量的间质α-SMA+细胞(成纤维细胞)是内皮细胞的来源。

4 miRNA在EndMT中的作用

miRNA可以通过抑制转录复合物间接地上调许多基因的表达。在血管内皮细胞中，TGF-β能够抑制磷酸酶以及人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)的活性，从而激活AKT，诱导miRNA-21的表达上调[18]。Smad3信号可增加miR-21在肾脏中的表达，促进由TGF-β引起的肾脏纤维化，而Smad2信号对miR-21的转录后修饰过程起负调控作用[19]。miR-23可以抑制TGF-β诱导小鼠内皮细胞的EndMT过程。通过miRNA芯片技术，Ghosh等[20]发现，在EndMT的过程中miR-125 b、let-7c、let-7g、miR-21、miR-30 b和miR-195的水平显著上升，而miR-122a、miR-127、miR-196和miR-375的表达水平下降。阻碍FGF信号可以诱导EndMT过程的发生，let-7b可以模仿这一过程诱导EndMT，而let-7c会抑制这一过程。虽然这些研究大多集中在血管内皮细胞中，但研究表明，特异性的作用于相应miRNA，如：抑制miR-21的上调或使miR-125b的表达下调，对于阻断肾脏中EndMT的诱导也许是一种可行的方法。

5 展望

目前已有的数据表明，在西方有近45%的人死于各种慢性纤维疾病[21]。EMT和EndMT已经成为器官纤维化研究的一个重要研究方向。EMT和EndMT参与各种纤维化疾病的发生发展，包括肾的纤维化，尽管人们在分子生物学水平上获得很多关于EMT和EndMT的分子机制，但是这些分子机制需要通过进一步研究人体临床病理资料来确认和验证。未来的研究工作应加强了解miRNA在肾脏疾病中的作用[22]，这些研究有可能会给人类肾纤维化疾病的治疗提供一种新的靶点和方法。

[1]Bartel DP.Micro RN As:target recognition and regulatory functions [J].Cell,2009,136:215-233.

[2]Kallure R,Weinberg RA.The basics of epithelial-mesenchymal transition[J].J Clin Invest,2009,119:1420-1428.

[3]Zeisberg M,Bottiglio C,Kumar N,et al.Bone morphogenic protein-7 inhibits progression of chronic renal fibrosis associated with two genetic mouse models[J].Am J Physiol Renal Physiol,2003, 285:1060-1067.

[4]Lopez-novoa JM,Nieto MA.Inflammation and EMT:an alliance towards organ fibrosis and cancer progression[J].EMBO Mol Med, 2009,1:303-314.

[5]Zhao H,Dong Y,Tian X,et al.Matrix metalloproteinases contribute to kidney fibrosis in chronic kidney diseases[J].World J Nephrol, 2013,2:84-89.

[6]Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression[J].Nat Rev Cancer,2002,2:442-454.

[7]Park SM,Gaur AB,Lengyel E,et al.The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2[J].Genes Dev,2008,22:894-907.

[8]Burk U,Schuberg J,Wellner U,et al.A reciprocal repression between ZEB1 and members of the miR-200 family promotes EMT and invasion in cancer cells[J].EMBO Rep,2008,9:582-589.

[9]Xia H,Ng SS,Jiang S,et al.miR-200a-mediated downregulation of ZEB2 and CTNNB1 differentially inhibits nasopharyngeal carcinoma cell growth,migration and invasion[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,391:535-541.

[10]Kong W,Yang H,He L,et al.MicroRNA-155 is regulated by the transforming growth factor beta/Smad pathway and contributes to epithelial cell plasticity by targeting RhoA[J].Mol Cell Biol,2008, 28:6773-6784.

[11]Gebeshuber CA,Zatlaokal K,Martinez J.miR-29a suppresses tristetraprolin,which is a regulator of epithelial polarity and metastasis[J]. EMBO Rep,2009,10:400-405.

[12]Ma L,Young J,Prabhala H,et al.miR-9,a MYC/MYCN-activated microRNA,regulates E-cadherin and cancer metastasis[J].Nat Cell Biol,2010,12:247-256.

[13]Du J,Yang S,An D,et al.BMP-6 inhibits microRNA-21 expression in breast cancer through repressing deltaEF1 and AP-1[J]. Cell Res,2009,19:487-496.

[14]He J,Xu Y,Koya D,et al.Role of the endothelial-to-mesenchymal transition in renal fibrosis of chronic kidney disease[J].Clin Exp Nephrol,2013,17:488-497.

[15]Medici D,Kalluri R.Endothelial-mesenchymal transition and its contribution to the emergence of stem cell phenotype[J].Semin Cancer Biol,2012,22:379-384.

[16]Zeisberg EM,Potenta SE,Sugimoto H,et al.Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition[J].J Am Soc Nephrol,2008,19:2282-2287.

[17]Li J,Qu X,Bertram JF.Endothelial-myofibroblast transition contributes to the early development of diabetic renal interstitial fibrosis in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Am J Pathol,2009,175: 1380-1388.

[18]Kumarswamy R,Volkmann I,Jazbutyte V.Transforming growth factor-beta-induced endothelial-to-mesenchymal transition is partly mediated by microRNA-21[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012, 32:361-369.

[19]Zhong X,Chung AC,Chen HY,et al.Smad3-mediated upregulation of miR-21 promotes renal fibrosis[J].J Am Soc Nephrol, 2011,22:1668-1681.

[20]Ghosh AK,Nagpal V,Covington JW,et al.Molecular basis of cardiac endothelial-to-mesenchymal transition(EndMT):differential expression of microRNAs during EndMT[J].Cell Signal,2012,24: 1031-1036.

[21]Wynn TA.Common and unique mechanisms regulate fibrosis in various fibroproliferative diseases[J].J Clin Invest,2007,117:524-529.

[22]Gomez IG,Grafals M,Portilla D,et al.MicroRNAs as potential therapeutic targets in kidney disease[J].J Formos Med Assoc, 2013,112:237-243.

R692.1+2

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1003—6350（2014）18—2723—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1068

2014-03-27)

黄卫锋。E-mail：huangwf006@126.com