人BMSCs复合载体支架修复软骨缺损的研究进展

易颖，金旭红，张寿

(海口市人民医院骨科中心，海南海口570208)

·综述·

人BMSCs复合载体支架修复软骨缺损的研究进展

易颖，金旭红，张寿

(海口市人民医院骨科中心，海南海口570208)

我们广泛查阅近年来有关人骨髓间充质干细胞及载体支架材料研究与应用的文献，并选择常见的几种细胞载体支架材料分别进行阐述。人骨髓间充质干细胞作为最实现性的细胞源，将在软骨组织工程的研究及应用中发挥重要的作用。理想的支架材料在种子细胞修复软骨缺损中起到事半功倍的作用。人骨髓间充质干细胞复合现有支架材料仍存在许多问题。将人骨髓间充质干细胞复合自体脱钙骨基质，成软骨诱导促进软骨缺损的修复，因其良好的稳定性与免疫学性能，值得今后更深入地研究。

人骨髓间充质干细胞；支架材料；永生化；脱钙骨基质；软骨缺损

由于外伤、创伤后慢性损伤、退行性变、关节退化等原因造成的关节软骨受损在临床上日趋常见。根据国际软骨修复协会建立的软骨损伤评价体系，将软骨损伤按严重程度分为五级。其中特别是缺损完全穿透软骨，到达软骨下骨更是临床难题。而关节软骨本身的再生修复能力十分微弱[1]，一旦受损，组织破坏往往从关节表面持续延展的关节深层。这样继续发展将导致关节性病变或骨关节炎，更严重的晚期只能进行关节置换治疗[2]。以往常用的骨髓刺激技术、自体或异体骨软骨移植、骨膜软骨膜移植等治疗方法因存在着纤维化、退化或者二期骨化的问题，都难以取得理想的效果[3]。组织工程再生医学技术的发展为其提供了一条新的思维方向。因此，如何修复软骨缺损成为目前组织工程研究的热点之一。

组织工程研究由种子细胞、支架材料、组织构建和细胞生长调节因子四大基本要素构成[4]。目前软骨细胞组织工程研究的热点及难点主要包括：寻找理想的种子细胞及其培养扩增方法、提供适当的细胞载体支架及固定方法和明确各种细胞因子的调控机理并诱导种子细胞分化等。

1 种子细胞的选择

软骨再生的潜在细胞源包括：同源软骨细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞等。间充质干细胞是最常用的软骨组织工程种子细胞，具有良好的多向分化潜能和增值能力。它可以从骨髓、脐血等全身多处组织中分离提取，在一定的诱导条件下能够分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等[5]。其中，骨髓是间充质干细胞的重要来源，具有取材简便、来源充足、免疫原性弱、分化能力强等特点[6-9]，是最实现性的细胞源。

以骨髓间质干细胞为基础的全层软骨缺损修复已经在动物模型中有广泛尝试，但在临床上应用于临床软骨修复的病例少见。在软骨再生治疗上还处于初期发展阶段是由于来自以下的几个挑战。

1.1 年龄对种子细胞的影响在临床上，随着时间不断磨损导致的退行性关节病变以及长期缺乏活动导致的关节退变的老年患者在关节软骨缺损的病例中占有不小的比例。这说明年龄与其具有非常重要的关系，年长的患者体细胞质量低下。随着年龄的增长，患者体内骨髓间充质干细胞的含量、质量和活性等是否也随之下降？国内外研究者目前看法并不一致。早在二十世纪末，Nishida等[10]研究提示随着年龄增长骨髓间充质干细胞自我更新能力逐渐下降。Pittenger等[11]研究人骨髓间充质干细胞的增殖能力与成骨方向分化的潜能，发现骨髓间充质干细胞的增殖能力与年龄及性别之间没有明显的关系。近年又有学者研究显示骨髓间充质干细胞的含量质量活性等随着年龄的增长而下降[12]。若采用同种异体骨髓间充质干细胞修复老年患者的关节软骨缺损又存在免疫排斥反应。

1.2 种子细胞的免疫学特点在自体种子细胞取材有限或适应证受限的情况下，可以考虑采用同种异体细胞。骨髓间充质干细胞具有低免疫原性，并且可以直接抑制活化的效应性CD4+T细胞增殖和激活并维持Treg细胞的潜能[13]。在异体间质干细胞分化成为功能性的软骨细胞，它们就会逐渐失去免疫抑制效应，其免疫原性得到增强。为了增加细胞数量而长时间的体外培养过程中，种子细胞的表型可能会发生自发的改变。这表明异体之间的间质干细胞因其免疫学的特点或许并不适用于软骨组织的修复。虽然低温冷冻可降低软骨细胞免疫原性，但也会导致软骨细胞活性丢失。目前研究多采用冷冻一周内的新鲜组织细胞移植，可尽量降低免疫排斥反应又能维持更长时间关节软骨的功能[14]。Froncois等[15]发现骨髓间充质干细胞不仅可递呈可溶性抗原，而且可介导CD8+T细胞免疫反应。骨髓间充质干细胞在体外可抑制细胞增殖，但体内试验却未能抑制移植物抗宿主反应。当间充质干细胞在体外诱导分化成成软骨细胞的过程中，其生物学特性发生了改变，原高表达的负性协同刺激分子下调，而多种原不表达的正性协同刺激分子不同程度的进行上调抗原提呈细胞的抗原递呈作用，将抗原信息传递给T细胞，引起T细胞活性。

1.3 种子细胞的永生化与致瘤性骨髓间充质干细胞在培养过程中存在着细胞老化、干细胞样特征丢失的现象。有研究者提出“永生化”的概念。Tsai等[16]将端粒末端转移酶反转录酶的片段phTERT-IRES2-EGFP转染入KP细胞，建立了3A6细胞系，发现新建立的细胞系与原始骨髓间充质干细胞相比，其增生能力、干细胞样特征均提高，多次传代导致细胞自动分化，干细胞样特征丢失的问题也得到一定解决。国外学者在体外利用基因转染技术，将尤因肉瘤易位癌基因家族蛋白基因植入人的间充质干细胞后，细胞的形态从纺锤体的外形变为小圆形或多角形，而后者其实是肿瘤细胞的形态之一。且原本间充质干细胞应有的表型如CD10、CD13等消失。相反，尤因肉瘤细胞的表型如CD54、CD99、CD117、CD271表达强度有明显的上调。这表明尤因家族肿瘤可能来自于人间充质干细胞[17]。还有更多的实验提示间充质干细胞可能与恶性肿瘤的关系密切，其恶性转化及移植后潜在的致瘤性引起普遍关注，人们越来越关心间充质干细胞移植治疗的安全性；上述问题目前还知之甚少，都有待深入阐释。

2 细胞载体支架的选择

以生物材料作细胞生长的三维支架，利用组织工程技术生产用于移植治疗的软骨组织成为当前研究热点。支架材料作为人工的细胞外基质，主要作用是模拟细胞在体内的生长空间，为细胞形成软骨提供一个继续增殖分化的微环境。它为软骨细胞提供三维空间结构，有利于细胞的粘附、增殖，为细胞的生长提供良好的生长环境。理想的支架材料要具备良好的生物相容性、生物降解性、良好的三维空隙结构、较好的承载能力与弹性以及不易脱落等特点[18]。目前尚无一种具有明确优势的组织工程支架具备以上所有特点，到目前为止，任何组织工程替代物都难以完全的模拟天然软骨的结构和性质[19]。

目前常用的支架材料按其来源分为人工合成支架材料、天然支架材料、复合支架材料和纳米生物材料。

2.1 人工合成支架材料由于在人工合成过程中能直观地设计和调控其微结构、机械强度等材料性能，并且易于生产，人工合成高分子支架材料是目前应用程度最广、研究最多的支架材料。目前常用的人工合成的高分子支架材料主要包括以下[20]：聚乳酸、聚乙醇酸、β-磷酸三钙、聚羟基乙酸、聚氧化乙烯等。研究者们通常将这些生物材料制成网状或海绵状，多孔的设计具有的特点是其材料的内部三维空间与细胞生存的环境相类似，使得细胞能高效率地进行新陈代谢。早在上世纪九十年代，Vacanti等[21]首先以聚羟基乙酸、聚乳酸作为软骨细胞体外培养基质材料，通过组织工程方法成功获得新生软骨。但其降解过快，降解产物在局部聚集影响局部酸碱平衡，从而产生炎症反应，影响种子细胞的生长增殖。同样其他人工合成支架材料也存在如亲水性弱、表面活性不足、粘附性弱、具有一定免疫原性等缺点。

2.2 天然生物支架材料目前应用于软骨组织工程的天然支架材料主要有：天然基质材料、胶原材料、壳聚糖、纤维蛋白、透明质酸等。天然生物支架材料来源于生物体本身，具有组织相容性较好、毒性较小、易降解且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应等优点，所以在组织工程中作为细胞培养的支架材料具有人工合成材料所不可比拟的优势。

2.2.1 天然基质材料采用脱钙松质骨基质作为支架材料相对生物合成高分子材料，从1965年首次提出了脱钙骨基质具有成骨诱导能力，到1979年提出骨形态发生蛋白学说，目前脱钙松质骨已广泛运用于组织工程研究。脱钙松质骨的主要成分是胶原，它保留了天然的骨蛋白和生长因子[22]，与细胞联合应用中具有骨诱导、骨传导及骨发生能力[23]。孔径大小一般控制在100～500 μm。材料具有生物降解性，其降解产物能被正常吸收，不对周围环境造成影响。pH值的变化小，不产生炎症反应。在骨缺损研究中，骨形态发生蛋白能诱导间充质干细胞分化为成骨细胞，进而生成新的骨组织[24]，并且能影响到邻近骨细胞，促进其分泌胶原支架。尤其取自体骨更能最大程度上降低抗原性，抑制免疫排斥反应，因此可以作为修复骨缺损及骨组织工程的支架材料，为骨缺损的治疗开辟了一条新途径。2007年，骨蛋白提取物作为新一代的脱钙骨基质修复材料开始成为热点。骨蛋白提取物是从长骨皮质骨中提取的浅黄白色、絮状的胶原基质冻干产物，含有Ⅰ型胶原及其他难溶性蛋白，如转化生长因子等。Baas等[25]和Ding等[26]分别进行狗和羊等动物实验中均无与骨蛋白提取物有关的并发症发生，表现出良好的生物相容性。在临床应用中，骨蛋白提取物已开始应用于关节翻修、脊柱融合、骨缺损等手术中。

2.2.2 胶原材料胶原作为细胞外基质的主要成分，含有利于细胞粘附的基团。胶原是主要的支持组织的结构蛋白，其中Ⅰ型胶原以粗纤维形式存在，可以形成较大的网络结构使组织具有较强的抗张能力，而Ⅲ型胶原的结构是以细纤维为主，组织通过细纤维而具有较强的可扩张能力。Ⅲ型胶原分布于全身各处，多见于皮肤、血管、肺、心脏等，一般是跟随Ⅰ型胶原的出现而出现的。软骨外基质占软骨比重的一半左右，软骨外基质的主要成分是由软骨细胞所分泌的Ⅱ型胶原。在软骨组织工程中，Ⅱ型胶原往往提示软骨细胞生长是否良好。在进行软骨细胞培养时，Ⅱ型胶原能为细胞的生长和增殖提供良好的微环境。胶原蛋白作为支架材料有利于细胞的粘附、增殖和分化，并能刺激软骨细胞分泌软骨基质Ⅱ型胶原和糖胺聚糖。胶原的降解产物氨基酸可以被机体完全吸收，其最大缺点是力学强度不够，被大大限制了应用，所以通常都是将胶原与其他材料复合或作为支架的表面修饰物以增加支架的细胞粘附性。

2.2.3 壳聚糖壳聚糖是常用的天然高分子材料，在生物的相容性和降解性上性能优异。再者，研究者根据实验需要选择相关的生物活性，只需要改造其侧链的修饰基团。一般地，多糖类大多可以作为软骨细胞载体。有学者将软骨细胞植入由壳聚糖制成立体支架，培养一段时间后显示有糖胺多糖及Ⅱ型胶原生成，这说明壳聚糖能维持软骨细胞的表型稳定性。壳聚糖使植入的种子细胞与宿主组织一体化。国外学者发现壳聚糖能使软骨种子细胞的形态学长时间内不易发生变化，并能使支架的粘附性和结构保持稳定。Hao等[27]用壳聚糖结合软骨细胞修复羊的软骨缺损，24周的培养后发现，羊的软骨缺损得到完全修复。另外，单纯的壳聚糖水凝胶，不结合细胞，也有助于对软骨缺损进行修复。

2.3 复合支架材料随着组织工程学技术的深入，单一的支架材料通常因为局限性，并不能满足软骨缺损修复的现实要求。复合多种支架材料可以发挥各自优点,可以促进组织工程产品的修复重建效果。复合材料是指将不同的材料按需要复合，或者利用物理、化学、生物等方式或仿生学原理改变或模拟现有材料的特性，使新生材料拥有需要的优势，规避劣势。复合材料可以是天然材料之间的复合或人工合成材料之间的复合，以可以使两者之间的交叉复合。目的只为得到具有我们需要的相关的支架材料。值得特别提出的是，目前刚起步的纳米生物材料。纳米技术在骨移植替代物有纳米羟基磷灰石、纳米骨浆、纳米脱钙骨基质、纳米级类骨磷灰石晶体等。纳米材料的结构优势在于有大量的界面或自由表面。结构单元之间存在一定的相互作用，互相影响。用纳米材料制成的支架其靶向性能和延展性能都具有优势。将纳米材料与其他材料复合能改变材料的力学性能。若复合生长因子，可能会大大地提高其作用。将其进行一定的技术处理或表面修饰，处理后的纳米材料或许是最理想的支架材料。

3 人骨髓间充质干细胞成软骨的定向诱导

骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞受到多种复杂因素的影响和调控，其中很多机制目前还不清楚。体外培养条件下需要控制细胞生活条件，选择合适的细胞因子，尽量模拟人体内成软骨环境，构建成熟的定向分化系统。骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导方法包括体外高密度微团培养、体外单层细胞培养、体外三维支架环境诱导、与软骨细胞体外共培养诱导剂基因转染诱导等。Noble等[28]于1995年首次成功地诱导了间充质干细胞向单一的软骨细胞分化。随后的大量研究也证实了骨髓间充质干细胞的体内体外成软骨能力[29]。间充质干细胞具有多向分化潜能，在人工培养条件下如果不添加细胞因子，会发生自然分化[30]，出现增殖能力下降，失去原有典型长梭形形态，向多分支和多角形发展。转化生长因子-β1对多种细胞的生长和分化都起作用。很早就有实验证实转化生长因子-β1可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞,转化生长因子-β1具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力,转化生长因子-β1和其他多种生长因子有协同作用。骨髓间充质干细胞在向软骨细胞分化的过程中，随着基因的激活，会合成软骨细胞特有蛋白质产物。其中的Ⅱ型胶原和糖胺多糖是细胞外基质中的主要成分，可以作为鉴定软骨细胞的标志物。生长分化因子5是近年发现的一种生长因子，属骨形态发生蛋白家族成员，也是转化生长因子超家族一员，也称为软骨源性形态发生蛋白1。它能影响到生长板软骨细胞肥大时期的长短，从而影响到内生软骨的生长速度。它通过上调缝隙连接蛋白Cx43的表达来促进人骨髓间充质干细胞微团向软骨定向分化。这在早期骨骼发育和关节形成与发育中发挥关键的作用。

4 展望

近年来，干细胞和组织工程技术的不断发展，为解决临床难题带来曙光。软骨组织工程已成为国内外学者的研究热点。将人骨髓间充质干细胞复合自体脱钙松质骨基质，成软骨诱导促进软骨缺损的修复，因其良好的免疫学性能，值得今后更深入地研究。然而，软骨组织工程技术并不完美，在进入临床应用以前还有很多问题等待解决，例如支架容易脱落，细胞在体内免疫性状的改变以及致瘤性的问题。都还需要进一步理解参与软骨再生的各种因素及其影响因子，同时还要在标准化动物模型研究中衡量积极因素和可能的有害影响。不过，相信随着对软骨组织工程研究的深入，大量实验研究及临床工作，必将进一步推动软骨组织工程由动物试验阶段向临床试验阶段过渡，并最终成功应用于临床。

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1003—6350（2014）01—0058—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.01.0021

2013-06-26)

海南省自然科学基金项目（编号：309107）

金旭红。E-mail：jxh53@sina.com