齐墩果酸抗原发性肝癌作用机制的研究

王 悦，吕邵娃，孙 爽，李永吉

( 黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

齐墩果酸(OA)是一种五环三萜类化合物，存在于自然界多种植物中，含量极其丰富.五环三萜化合物是一类因其具有多靶点调控能力而极具抗肿瘤研发价值的植物次级代谢产物[1].OA还具有保肝、降脂、降糖、调节免疫等多种药理作用.研究表明，其对于原发性肝癌的防治具有确切疗效[2-3].本文综述了近年来国内外对OA抗HCC分子水平作用机制的最新研究进展.

1 齐墩果酸抗肝癌作用的途径

OA的抗肝癌作用几乎贯穿了肿瘤发展的各个阶段，其作用机制包括诱导肿瘤细胞的凋亡，细胞周期阻滞，抑制肿瘤血管生成、肿瘤细胞的侵袭和转移等途径[4].其中，诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞是其抗肝癌作用的主要途径.

1.1 齐墩果酸诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡这一概念是1972年由Kerr提出的[5]，与细胞坏死构成了细胞死亡的2种方式.细胞坏死是病理性的非正常死亡，是被动死亡；而细胞凋亡是指为了维持内环境的稳定，由基因来控制细胞自主有序死亡的主动过程.它涉及一系列基因的激活、表达及调控等作用.Sheng-lei Yan等研究表明[6]，OA能够诱导人肝癌HepG2、Hep3B、Huh7和HA22T细胞株凋亡.其诱导细胞凋亡主要通过四种通路发挥作用：1)线粒体通路：MING-HUAN SHYU等研究表明[7]，线粒体通路是OA诱导肝肿瘤细胞凋亡的主要途径.它通过调节抗癌基因和相关酶类，控制脂解作用，使脂肪分解为游离脂肪酸，并进入线粒体进行β氧化，产生活性氧(ROS).线粒体ROS可以促进促凋亡基因Bax、抑制抗凋亡基因Bcl-2的转录，进而调控线粒体细胞色素C及其他凋亡因子的释放.细胞色素C与相关的凋亡蛋白激活因子形成凋亡小体，在细胞质中的脱氧三磷酸腺苷(dATP)和ATP的作用下，启动caspase级联反应，执行凋亡.2)内质网通路：McCullough KD等报道[8]，内质网通路可能是通过凋亡信号下调Bcl-2，耗竭谷胱甘肽及增加活性氧等机制促进细胞凋亡.OA能够抑制Bcl-2的转录，启动内质网通路.内质网通路是肿瘤细胞凋亡通路之一，它有一套独立的信号传导系统.当内质网生理功能损坏时，会引起内质网应激反应(ERS)[9]，维持细胞内的稳定，恢复细胞功能.但当细胞损害过于严重，内质网不能恢复细胞功能时，ERS就会转换成促凋亡模式，启动caspase级联反应，执行凋亡.3)死亡受体通路：肿瘤坏死因子TNF和Fas死亡受体家族是主要的死亡受体.OA诱导死亡受体与相应的配体结合，形成死亡受体三聚体.死亡受体家族在细胞内介导细胞凋亡的区域即死亡结构域，与凋亡相关因子前体结合，形成死亡诱导复合体，进而引起cascase级联反应，诱导细胞凋亡[10-11].4)溶酶体通路：OA诱导的溶酶体通路一方面与线粒体通路相互协调，促进线粒体通路的进行，称为线粒体-溶酶体途径；另一方面也可以独立完成细胞凋亡过程[12].与线粒体-溶酶体途径相关的关键酶是组织蛋白酶，OA诱导线粒体途径产生的活性氧ROS可以影响到线粒体附近的溶酶体，使溶酶体膜通透性增大，溶酶体内多种分子质量较小的小于阈值的组织蛋白酶就会从溶酶体中泄露出来，作用于线粒体外膜上的Bid等细胞凋亡因子，参与并促进线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡.此外，OA也可以使促凋亡信号刺激溶酶体，使溶酶体膜通透性增大，释放组织蛋白酶等促凋亡因子，直接引起caspase级联反应，进入细胞凋亡过程.Jianteng Wei等通过实验[13]，探讨了OA诱导胰腺癌细胞凋亡的线粒体通路和溶酶体通路，也提示了OA诱导肝癌细胞凋亡的途径.

1.2 OA诱导肝癌细胞周期阻滞

研究表明[14]，OA通过对ERK-p53、p21信号和相关周期蛋白的调节，诱导肝癌细胞G2/ M期阻滞.细胞周期是指细胞从一次有丝分裂产生新细胞开始，到下一次有丝分裂形成子细胞为止经历的整个过程，分为间期和裂期.间期可以分为DNA合成前期(G1期)、DNA的合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)三个时期；有丝分裂期为M期.正常细胞中 ，在 G1/S 期、S 期及 G2/M 期的转换都是受到多个调控因子和多个检测点严密调控的，以保证其协调有序并且精确的进行.在不同的细胞周期，负责调控周期进程的细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)和细胞周期蛋白(cyclin)有所不同，因此起作用的 Cdk-cyclin 复合物亦不同.当这些调控因子和检测点功能发生紊乱时，就会导致肿瘤的发生发展.黄开顺等[14]研究表明，OA能够通过对相关因子的调节，抑制相关Cdk-cyclin 复合物的活性，诱导肝癌细胞G2/ M期停滞.

1.3 OA抑制肿瘤血管生成及肿瘤细胞的侵袭和转移

Chun-Che Lin等报道[15]，OA能够影响肝癌Hep3B、Huh7和HA22T细胞株的浸润和迁移.OA通过调控血管内皮生长因子及其他相关因子的表达，从而抑制肿瘤新生血管的生成、侵袭和转移[4].肿瘤因能够诱导血管生成而具有大量丰富的血管，其生长、侵袭和转移都依赖体内氧气和营养物质的供给，血管又是提供氧和营养物质的主要渠道，因而肿瘤的侵袭和迁移是依赖肿瘤血管的生成进行的.抑制肿瘤血管的生成是抑制肿瘤生长和转移的核心.肿瘤血管的生成与细胞含氧量有关.肿瘤的过度增殖会导致肿瘤细胞严重缺氧，在无氧环境时，乏氧诱导基因会结合成二聚体，启动能够促进肿瘤血管生成的血管内皮生长因子的转录，并使其表达增加，从而适应氧气与营养物质的缺乏，进而生长和转移.

2 齐墩果酸影响肝肿瘤细胞的相关因子

2.1 ERK-p53信号

OA通过对苏氨酸蛋白激酶p53信号(ERK-p53)的调节，诱导线粒体通路和细胞周期阻滞.其中，ERK-p53信号在这两个过程中发挥了核心作用[16].ERK存在于胞浆内，是一种细胞外信号调节激酶，与JNK和MAPK共同构成了MAPK家族.ERK主要包括ERK1和ERK2两个亚型，负责将信号从表面受体传导至细胞核.磷酸化激活的ERK由胞质转至核内，从而参与细胞的增殖、分化，维持细胞形态，细胞凋亡和细胞恶变等多种生理反应[17].YU通过MTT法证实[18]，熊果酸(UA)通过p53诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡.Li Liao等实验[19]，证明OA对SMMC-7721细胞具有细胞毒性.UA是OA的同分异构体，因此两实验研究提示了OA对p53信号的作用.p53是一种抗癌基因(tumor suppressor gene).恶性肿瘤的产生，50%以上的原因就是该基因发生突变失活，且p53基因编码的p53蛋白是一种转录因子，控制细胞周期的启动.在肝癌细胞中，OA磷酸化激活ERK，使p53表达增加，从而调控细胞凋亡和细胞周期阻滞.

2.2 环腺苷3'，5'-单磷酸反应元件结合蛋白(CREB)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)与β氧化(FAO)

Xin Wang等报道[16]，在OA线粒体通路诱导细胞凋亡过程中，环腺苷3'，5'-单磷酸反应元件结合蛋白CREB能够通过调控过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)和脂肪酶(HSL)，控制脂解作用，进而启动肝癌细胞凋亡.p53负责CREB的激活.PPAR分为α、β、γ三种压型，其中γ亚型主要表达于脂肪组织及免疫系统，在脂肪组织中诱导脂肪的形成.研究发现[20]，没有PPARγ脂肪就不会形成.HSL则通过水解甘油二酯和甘油三酯而发挥脂解作用，是脂肪分解的关键酶之一.CREB能够抑制PPARγ的表达，同时上调HSL，从而启动脂解程序.

脂肪分解为游离脂肪酸(FFAs)，进入线粒体进行β氧化(FAO)，产生活性氧(ROS).同时，PPARγ辅激活因子1α(PGC-1α)的过度表达，通过调节脂质代谢基因，能够增加脂肪酸的氧化能力.PGC-1α作为一种转录共调节因子，调控基因转录水平.机体的代谢途径至少有一部分是通过调控基因转录水平来完成的[21].氧化游离的脂肪酸是线粒体ROS的主要来源，而ROS的产生是线粒体凋亡的主要原因[22].ROS[23]可以促进促凋亡基因Bax、抑制抗凋亡Bcl的转录，Bax和Bcl是Bcl-2癌基因家族的成员.Bcl-2家族蛋白是一种膜整合蛋白，存在于细胞核膜、内质网膜和线粒体上.Bcl-2主要分为促凋亡蛋白(Bax和Bak等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL等)两种，是细胞凋亡的主要调节者.Bc1-2蛋白家族能够调控线粒体细胞色素C及其他凋亡分子的释放、线粒体ROS的大量产生，能够使线粒体膜电位下降，通透性增强，使细胞色素C释放到细胞质中，形成凋亡小体，推动OA线粒体通路凋亡进程.

2.3 p21信号与cyclin B1-Cdc2 复合物

季宇彬等报道[24]，cyclin B1-Cdc2 复合物是细胞周期G2/M 期检测点起作用的关键调节因子，又称有丝分裂促进因子(MPF).当细胞在 G2期DNA受损或癌变时，OA就会通过对ERK-p53基因的调控，使p21表达上调，抑制 cyclin B1/ Cdc2的活性，阻止细胞进入M期.p21是细胞周期重要的调控基因，位于p53下游，是细胞周期依赖性激酶抑制因子，能够抑制cyclin B1/cdc2的活性.细胞G2/ M期阻滞，使得细胞有充分的时间来修复受损的DNA，并阻止癌细胞有丝分裂而增殖.

2.4 HIF-1α与VEGF

OA能够使乏氧诱导基因HIF-1α与内皮生长因子VEGF的表达下调，从而抑制肿瘤新生血管的生成、侵袭和转移.JIA通过实验[25]，证实了肝细胞癌(HCC)中HIF-1α和VEGF的表达及其临床意义.HIF-1 是一种异二聚体，位于细胞核内，分为HIF-1α和 HIF-1β两个亚型，是调节细胞缺氧反应最重要的转录因子之一[26].VEGF也是OA作用的靶点之一，研究发现[27]，VEGF在缺氧环境下被诱导生成，能够促进肿瘤新生血管生成，同时也与肿瘤的侵袭和迁移有关.在正常的肝细胞中，含氧量正常，肿瘤抑制基因(VHL)能够调控HIF-1α的降解， HIF-1α经脯氨酸羟化酶羟基化，后与VHL泛素化形成泛素蛋白酶体，作用于HIF-1α，使之降解.在无氧环境时，乏氧诱导基因HIF-1α和 HIF-1β结合成二聚体，启动VEGF的转录并增加VEGF mRNA的稳定性，使VEGF的表达增加.HIF-1α与VEGF 是OA抑制肿瘤血管生成的主要靶点.

3 肝癌细胞凋亡与级联反应机制

Yan SL等研究表明[28]，OA线粒体通路诱导肝癌细胞凋亡途径中，caspase-3和caspase-9裂解产生的活性酶能够裂解聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP).PRAP是DNA修复酶，PARP的裂解灭活直接导致DNA修复功能的丧失，使基因组不能维持稳定，从而促使细胞凋亡.Zhang W等实验[29]，用齐墩果烷三萜类化合物处理HepG2细胞并用MTT法测定，结果表明caspase酶家族是主要的凋亡触发通路.另有报道[30]，OA内质网通路中，内质网应激反应转换成促凋亡模式时，胞质中的caspase-7激活后易位到内质网膜，切割活化caspase-12，活化后的caspase-12进而激活caspase-9和caspase-3，引起caspase级联反应，最终导致细胞发生凋亡，此过程中caspase-9和caspase-3的激活与线粒体途径中二者的激活无关，而是内质网途径自身的信号传导通路.此外，有文献报道[31]，熊果酸对乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性与caspase-8和死亡受体DR4和DR5有关，提示了OA诱导细胞凋亡的死亡受体通路与caspase级联反应有关.死亡受体通路中，死亡受体家族在死亡结构域与caspase-8或caspase-10前体结合，形成了死亡诱导复合体，进而切割激活caspase-8和caspase-10，更进一步活化caspase-9和cascase-3，引起cascase级联反应，诱导细胞凋亡.OA诱导的所有细胞凋亡途径最终都是通过激活caspase级联反应发生的[32].caspase 家族是细胞凋亡的主要执行者，分为凋亡相关因子和炎症介导因子.凋亡相关因子包括启动因子和执行因子，caspase-2，8，9，10等都属于启动因子，它们能与死亡信号传导通路中的分子结合成二聚体，通过自身的催化和识别作用，激活下游的执行因子(caspase-3，6，7等)，分解相关蛋白及核酸，执行凋亡.caspase家族之间可以相互激活，导致级联反应，从而不断促使细胞凋亡的发生.[33]

4 结 语

综上所述，OA一方面通过线粒体通路、内质网通路、死亡受体通路和溶酶体通路诱导肿瘤细胞凋亡，表现出对肝癌的抑制作用.另一方面，其通过p21介导的cyclin B1/cdc2的下调，诱导细胞周期阻滞.每种抗肝癌的途径都不是孤立的，而是相互协调、相互影响的.此外，研究证实[16]，OA的毒性作用具有细胞类型特异性，能够诱导肝癌细胞凋亡，而对人正常肝细胞无影响.但其对于正常细胞无影响的原因及分子机制尚不明确，有待进一步研究.

参考文献：

[1] POLLIER J,GOOSSENS A. Oleanolic acid [J]. Phytochemistry, 2012, 77:10-15.

[2] 温少瑾, 郝敬全, 江劲波. 中药诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展[J]. 湖南中医杂志, 2013, 29(5): 125-127.

[3] HUANG Z J, FU J J,LIU L,etal. Glycosylated diazeniumdiolate-based oleanolic acid derivatives: synthesis,in vitro and in vivo biological evaluation as anti-human hepatocellular carcinoma agents [J]. Organic & Biomolecular Chemistry, 2012, 10(19):3882-3891.

[4] 李 旸, 刘卓刚, 吴 斌. 齐墩果酸的抗肿瘤作用机制[J]. 实用医学杂志, 2010, 26(20): 3830-3832.

[5] KERR J F, WYLLIE A H, CURRIE A R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics[J]. British Journal of Cancer,1972,26(4): 239-245.

[6] YANA S,HUANG C, WU S,etal. Oleanolic acid and ursolic acid induce apoptosis in four human liver cancer cell lines [J]. Toxicology in Vitro, 2010, 24(3): 842-848.

[7] SHYU M H, KAO T C, YEN G C. Oleanolic acid and ursolic acid induce apoptosis in HuH7 human hepatocellular carcinoma cells through a mitochondrial-dependent pathway and downregulation of XIAP [J]. Journal of Agricultural and food chemistry, 2010, 58(10): 6110-6118.

[8] MCCULLOUGH K D, MARTINDALE J L, KLOTZ L O,etal. Gadd153 sensitizes cells to endoplasmic reticulum stress by down-regulating Bcl2 and perturbing the cellular redox state [J]. Molecular and cellular Biology, 2001, 21(4): 1249-1259.

[9] 张凯强, 张 颖, 顾何锋, 等. 内质网应激与细胞凋亡研究进展 [J]. 口腔医学, 2013, 33(6): 415-417.

[10] 赵美玲, 季宇彬, 毕明刚. 细胞凋亡的死亡受体途径[J].黑龙江医药,2013,26(2): 196-199.

[11] HSU Y L, KUO P L, CHIANG L C,etal. Involvement of p53,nuclear factor kB and Fas/Fas ligand in induction of apoptosis and cell cycle arrest by saikosaponin d in human hepatoma cell lines [J].Cancer Letters, 2004, 213(2): 213-221.

[12] 赵 凯, 卫涛涛. 溶酶体与细胞凋亡[J]. 生命科学, 2011, 23(11): 1063-1068.

[13] WEI J T,LIU M,LIU H Z,etal. Oleanolic acid arrests cell cycle and induces apoptosis via ROS‐mediated mitochondrial depolarization and lysosomal membrane permeabilization in human pancreatic cancer cells [J]. J. Appl. Toxicol., 2013, 33?(8): 756-765.

[14] 黄开顺, 朱链链, 刘 丹, 等. 齐墩果酸对肝癌细胞Hep3B增殖和凋亡的作用研究[J].第三军医大学学报, 2011, 33(5): 531-534.

[15] LIN C C, HUANG C Y, MONG M C,etal. Antiangiogenic Potential of Three Triterpenic Acids in Human Liver Cancer Cells [J]. Journal of Agricultural and food chemistry, 2011, 59(2):755-762.

[16] Wang X, BAI H, ZHANG X D,etal. Inhibitory effect of oleanolic acid on hepatocellular carcinoma via ERK-p53-mediated cell cycle arrest and mitochondrial-dependent apoptosis[J]. Carcinogenesis,2013, 34(6): 1323-1330.

[17] 钟 巍, 谢渭芳. 细胞外信号调节激酶在肝病治疗中的研究进展[J]. 国际消化病杂志, 2010, 30(3): 132-134.

[18] YU Y X, GU Z L, YIN J L,etal. Ursolic acid induces human hepatoma cell line SMMC-7721 apoptosis via p53-dependent pathway [J]. Chinese Medical Journal, 2010, 123(14):1915-1923.

[19] LIAO L,ZHOU X,LIU Y L,etal. Four new triterpenoidal saponins from Ilex cornuta and their cytotoxic activities [J].Phytochemistry Letters,2013, 6(3): 429-434.

[20] WANG L,LIU J,SAHA P,etal. The orphan nuclear receptor SHP regulates PGC-1αexpression and energy production in brown adipocytes[J]. Cell Metabolism,2005,2(4): 227-238.

[21] 李密杰, 张春梅, 蓝贤勇, 等. 共激活因子PGC-1α的研究进展[J]. 中国牛业科学, 2012, 38(4): 35-38.

[22] 闫华超，李林尉. 抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展[J]. 聊城大学学报:自然科学报, 2009, 22(3): 42-47.

[23] LIU L, J FU J J, LI T T,etal. NG, a novel PABA/NO-based oleanolic acid derivative, induces Human hepatoma cell apoptosis via a ROS/MAPK-dependent mitochondrial pathway [J]. European Journal of Pharmacology,2012, 691(1-3): 61-68.

[24] 季宇彬，高 鹏，邹 翔. G2/M 检验点调控机制研究概述[C]//2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集,2008

[25] JIA Z Z,JIANG G M,FENG Y L. Serum HIF-1alpha and VEGF levels pre- and post-TACE in patients with primary liver cancer [J]. Chin Med Sci J., 2011, 26(3):158-162.

[26] 刘杰文, 路喜安, 郝丽芬, 等.缺氧诱导因子-1与肿瘤[J].中国药物与临床,2013,13(5): 624-625.

[27] FENG J, ZHANG Y, XING D. Low-power laser irradiation(LPLI) pro-motes VEGF expression and vascular endothelial cell proliferation through the activation of ERK/Splpathway[J]. Cell Signal, 2012, 24(6) : 1116-1125.

[28] YAN S L, HUANG C Y, WU S T,etal. Oleanolic acid and ursolic acid induce apoptosis in four human liver cancer cell lines. Toxicol In Vitro, 2010, 24: 842-848.

[29] ZHANG W, POPOVICH D G. Group B oleanane triterpenoid extract containing soyasaponins I and III from soy flour induces apoptosis in Hep-G2cells. Journal of Agricultural and food chemistry, 2010,58(9): 5315-5319.

[30] 曾惠爱, 刘先领. 内质网应激与肿瘤细胞凋亡[J]. 肿瘤防治研究, 2013, 40(2): 206-208.

[31] HAWAS U W, GAMAL-ELDEEN A M, EL-DESOUKY S K,etal. Induction of caspase-8 and death receptors by a new dammarane skeleton from the dried fruits of Forsythia koreana [J]. Z Naturforsch C., 2013, 68(1-2): 29-38.

[32] 魏鉴腾. 齐墩果酸的抗肿瘤作用及其作用机制研究[D]. 北京: 中国科学院研究生院(海洋研究所), 2012.

[33] 黄成钢，阎新佳，邹晓祺，等.青龙衣的化学成分和抗肿瘤活性研究[J]. 哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2014，30(5)：517-521，541.