精子DNA碎片与辅助生殖结局关系的研究进展

王志强，杨 杰(综述)，倪亚莉，柴三明(审校)(甘肃省妇幼保健院生殖医学中心，甘肃 兰州 730050)

·综述·

精子DNA碎片与辅助生殖结局关系的研究进展

王志强，杨 杰(综述)，倪亚莉，柴三明*(审校)
(甘肃省妇幼保健院生殖医学中心，甘肃 兰州 730050)

生殖技术，辅助；活性氧；精子DNA碎片

我国不孕症患病率大约为10%～15%，而在众多的不孕原因中，男方因素所致不孕可达40%。约10%正常男性以及20%～25%不育男性都有较严重的精子DNA损害[1]。精子DNA损伤可能会对精子的正常受精能力以及受精以后的胚胎发育过程产生影响，并通过人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)造成医源性的传播。对于男性不育患者，尤其是严重少弱精和非阻塞性无精症患者，如何通过ART技术降低可能因精子DNA异常所致的不良妊娠事件和新生儿出生缺陷的发生率，改善妊娠结局，是生殖医学发展亟待解决的难题。现就精子DNA碎片研究进展及其与辅助生殖结局的关系综述如下。

1 精子DNA碎片产生机制

精子是一种具有特殊形态的高度分化细胞，其特定的形态在一定程度上可以保护精子DNA免受外界毒物的损伤。精子DNA碎片的形成主要由其内部因素所致，形成机制包括：①精子染色质组装缺陷、内源性核酸酶(拓扑异构酶Ⅱ)异常；②凋亡异常；③氧化应激是产生精子DNA碎片的主要原因，同时非整倍体也可以引发精子DNA碎片的产生，疾病、高热、睾丸局部温度增高、环境毒物、吸烟、药物和年龄等原因也可能造成精子DNA 的损伤。

1.1 活性氧对精子DNA的损伤：精液中活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生过多或消除减少，都会导致精子ROS高于正常水平。形态或功能异常的精子、精液中白细胞的异常聚集、阴囊温度过高、精索静脉曲张、年龄增长以及吸烟等不良嗜好都可使精子ROS水平上升[2]。同时，当机体自身的抗氧化能力出现异常而不能及时清除过多的ROS时，也会使精子ROS超过正常水平。活性氧可参与精子的超活化、精子获能、顶体反应以及其他一些生育相关的分子生物学过程。生理状况下，精子内部ROS始终维持在相对稳定的水平，当精子ROS水平超出了精子的抗氧化防御系统导致精子处于氧化应激状态时，不仅会影响精子的正常受精能力，同时还会对受精以后的胚胎发育过程产生影响。

精子内部含有丰富的多元不饱和脂肪酸，精子DNA的损伤修复能力相对有限以及精子抗氧化能力相对较弱，这使得精子更容易受到高水平ROS的影响。ROS对精子的损伤作用主要是通过引起脂质过氧化、损伤精浆蛋白和DNA来体现的；此外，精子线粒体作为产生ROS的细胞器，当细胞内ROS达到一定水平之后，也会受到ROS的损伤，大量线粒体被破坏，由于能量的缺乏，可使精子活力明显下降[3]。精子DNA完整性与妊娠过程密切相关，DNA发生氧化损伤的精子依然有能力与卵母细胞结合受精，但是损伤的DNA一旦整合到胚胎基因，它将可能导致发育过程中的胚胎DNA在复制、转录和翻译时发生错误，从而引起各类不良妊娠结局[3-4]。

1.2 精子DNA碎片与蛋白组学改变：正常成年男性一次射出的精液包含多种细胞成分和不同发育阶段的精子。含有大量精子DNA碎片的精液中，其精子蛋白组学可能会发生改变。①碎片基因的翻译错误，因为精子蛋白的转录和翻译过程在精子形成之前一直处于十分活跃的状态，错误的DNA信息可通过转录和翻译过程传递给新合成的蛋白[5]。②在精子的储存、成熟和运输过程中，附睾液与精子膜蛋白之间以主动转运为基础的蛋白交换也可引起精子蛋白组学的改变。正常状况下，附睾液和精子膜蛋白之间存在大量的蛋白交换，精子细胞膜通过不断向内主动转运附睾分泌蛋白的同时，也会移除特定的睾丸蛋白。鱼精蛋白是含量最为丰富的精子核蛋白，但其具体的作用机制尚不明确，生殖医学研究对其生理作用作出了3种可能的推测，即浓缩精子细胞核、保护父系基因免受核酸酶和自由基的损伤以及基因印记。带正电荷的鱼精蛋白可以通过与带负电荷的精子DNA结合，形成紧密的DNA-鱼精蛋白复合体，因此，当精子蛋白组学发生改变致使鱼精蛋白缺乏或形成的DNA-鱼精蛋白复合体受损时，增加DNA碎片形成的可能性。

2 精子DNA碎片检测方法

虽然精子DNA完整性的检查目前尚未纳入不孕症临床常规检查，但其对辅助生殖治疗的短期受精评估、胚胎发育、结局预测以及长期的子代健康影响都有十分重要的意义。彗星实验(COMET assay)被认为是目前现有的DNA碎片检测方法中最敏感的，它可以检测包括单链损伤、双链损伤以及碱基位点的破坏等多种精子DNA异常[6]。通过彗星实验检测精子DNA碎片时，需要的精子细胞数较少，这使得彗星实验更适合对严重少弱精患者精子DNA完整性进行评估。研究[7]表明，相比单纯的精子活力检查，彗星实验在ART中具有更高的诊断和预测价值。但是，要将彗星实验应用到常规的精子DNA实验室检查体系，还必须对其过程进行最优化和标准化，测定其检测的敏感度和特异度，评估测量的重复性。

除了彗星实验，在精子DNA碎片检测方面应用较为广泛的方法还有原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)、精子染色体结构试验(sperm chromatin structure assay,SCSA)以及精子染色体扩散实验(sperm chromatin dispersion,SCD)。其中，TUNEL实验可以直接检测精子DNA单链和双链的损伤，且在检测之前不需进行精子DNA变性，操作简单，是目前精子DNA碎片检查的重要方法之一。SCSA法是通过流式细胞仪分析吖啶橙与单链或双链DNA结合后产生的不同荧光而对精子DNA完整性进行评估的一种方法，此法为定量检测，敏感性高，操作方便，检测时间短，能在几秒钟内快速检测5 000个精子细胞，且目前已有标准化的DNA断裂程度衡量标准，在世界范围内得到普遍认可，甚至被称为精子DNA碎片检测的“金标准”。SCD法检测精子DNA碎片时，对精子进行特定处理后可直接在光学显微镜进行观察，且整个过程能够保持精子尾部的完整。该法操作简单，费用低廉，组间和组内变异较小，已被越来越多的机构认可。然而，任何一种检测方法都有其本身的优缺点，要想将其应用到临床进行精子DNA完整性的常规检查并对ART治疗结局作出相对准确的诊断和预测，尚需得到进一步研究证实。

3 精子DNA碎片与ART结局的关系

研究[8]表明，不同程度少弱精和畸形精子症患者精子DNA碎片明显升高。通过TUNEL实验和彗星实验评估DNA碎片指数(DNA fragment index,DFI)，发现DNA碎片能够明显影响体外受精(in vitro fertilization,IVF)和卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的助孕结局[9]，从精液常规分析和精子DNA碎片之间的关系发现，精液常规分析显示精液参数异常以及由遗传或非遗传因素所致的非梗阻性无精症患者精子DFI显著增高[10]。但是，精子DNA碎片是否能够为ART临床提供更准确的预测信息，尚未得到一致的认可。通过研究啮齿类动物，发现含有DNA碎片的精子虽然能够使卵母细胞受精并形成高质量的胚胎，但与其后续的胚胎着床、胚胎发育、表观遗传改变、脏器肥大、神经发育和行为异常以及肺和皮肤实体肿瘤的发生都有明显的相关性[11]。有报道称，精子DNA碎片对IVF受精率、卵裂率、种植率和妊娠率均没有影响[12]，而在ICSI周期中，精子DFI可对种植率和妊娠率产生明显的负面影响[13]。许多ICSI出生的婴儿发生生殖泌尿系统畸形被认为可能与精子挑选失败有关。尽管如此，由于缺乏更好的治疗手段和仪器设备，在严重少弱精和畸形精子症等被认为含有较多精子DNA碎片的患者中，目前仍首选ICSI进行授精。精子DNA碎片与ART受精率之间的关系也一直存在争论。有研究[14]认为，精子DNA碎片可对辅助生殖IVF和ICSI受精率产生明显影响，导致男性生育能力低下甚至不育。而Benchaib 等[15]研究显示，当精子DNA碎片<10%时，无论采取IVF还是ICSI授精，都不会对受精率产生影响。有研究[16]认为，精子DNA碎片对预测流产有一定的价值。但Brahem 等[17]的报道却恰恰相反，他们认为精子DNA碎片与流产之间没有任何关系。在最近一项有关精子DNA碎片和复发性流产的前瞻性队列研究中也没有发现精子DNA碎片对复发性流产有任何预测价值，在复发性流产患者夫妇中，男性精子DNA碎片指数与正常对照组之间没有差异[18]。同样，精子DNA碎片与卵裂期胚胎和囊胚发育之间的关系，目前仍没有一致的结果[15,19]。

总之，精子DNA碎片对生殖过程的影响尚不能通过现有研究得出结论，但是精子DNA的完整性可能与整个生殖过程之间存在密切的关系，是生殖医学和男科学发展中的重要课题。

4 降低精子DNA碎片的方法及对生育的影响

研究[20]认为补充抗氧化维生素及其他抗氧化剂可以有效减少精子DNA碎片，采用维生素E和维生素C进行抗氧化治疗虽然能够降低精子DNA碎片，但维生素C在发挥其抗氧化活性的同时，能够通过打开蛋白质二硫键干扰父方基因活性而使精子DNA发生去浓缩，影响精子功能。高达40%的不孕男性精子ROS维持在较高水平，但由于引起精子DNA产生损伤而形成DNA碎片的ROS阈浓度并不确定，这使得抗氧化剂的使用和患者的选择尚未得出统一的标准。有文献[21]报道，对先天性少弱精患者经过90d的重组卵泡刺激素(recombinant follicle stimulating hormone，rFSH)的治疗后，其精子DNA碎片得到了明显的改善，但接受维生素抗氧化治疗组治疗前后差异并无统计学意义。而经过rFSH治疗好转后是否能够提高ART治疗的临床妊娠率目前并不清楚。吸烟被认为与精子DNA碎片和不良精液参数有关，同时，吸烟与子代肿瘤的发生也有明显相关[22]。有研究[23]作出推断，精子DNA碎片可能对子代肿瘤的发生存在潜在的影响。因此，育龄期夫妇应尽量戒除吸烟等不良嗜好，远离具有潜在生殖毒性的各种毒物和药物，建立健康良好的行为生活方式。除了对患者进行药物干预和行为指导，在接受辅助生殖技术助孕时，精子的体外优化处理十分重要。目前，精子的体外处理方法主要为上游法和密度梯度离心法，二者都可以很大程度对精子进行优化选择。相比上游法，经密度梯度离心法处理后的精子具有更高的DNA完整性[24]。密度梯度离心法由于长时、高速的离心以及经受梯度试剂的影响，本身可增加精子DNA碎片。但密度梯度离心法对精子的损伤与辅助生殖的关系，除了部分研究认为密度梯度离心法可能会影响后期的囊胚发育外[19]，并无证据提示其对精子的损伤可产生更多不良后果。

5 研究前景与挑战

传统的精液常规检查从形态学角度出发，采用相差显微镜，评估精液的4种辅助参数，即精液体积、精子密度、活力以及精子形态。但是，这些形态学特征在男性生育能力和精子功能的评估方面具有很大的局限性。从以上有关最新研究推断，精子DNA碎片检查可能是一种具有预测价值的精子功能评估方法，精子DNA完整性也有很大潜力成为一种生物标记物用来分析IVF过程中出现的胚胎分裂异常、高流产率及复发性流产等问题。然而，由于受当前生殖医学对精子DNA的认识和检测方法的限制，尚没有标准化的精子DNA碎片检测体系和精子DFI对生育能力的预测模型。同时，精子DNA完整性对辅助生殖技术中配子的受精、发育、种植以及临床妊娠率和流产率的影响未能在学界达成共识，暂时只能将其作为男性生育能力评估的参考方法。因此，标准化男性精子DNA实验室检测技术，寻找有效的精子DNA损伤临床治疗方法，开发相对准确的ICSI精子选择手段以及高特异无侵入性的精子功能评估方法对于现代辅助生殖技术的发展具有十分重要的意义。

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(本文编辑：许卓文)

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《河北医科大学学报》编辑部

2014-04-02；

2014-04-21

甘肃省青年科技基金计划项目(1107RJYA062)

王志强(1986-)，男，甘肃定西人，甘肃省妇幼保健院医师，医学硕士，从事人类辅助生殖技术研究。

R711.6；R21.33

A

1007-3205(2014)12-1485-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.12.045

*通讯作者。E- mail:chaisanming@163.com