细胞色素P4502C19基因多态性检测与氯吡格雷临床应用的相关性研究

曹艮元，闫国强

氯吡格雷（商品名波利维）一种临床常用的血小板聚集抑制剂，通过与血小板膜表面二磷酸腺苷（ADP）受体选择性的不可逆结合，继而抑制ADP介导的通路活化而发挥作用。氯吡格雷为药物前体，本身无活性，需被细胞色素P450（CYP）酶系转化为活性状态（clopidogrel）方可发挥作用，其中细胞色素P450 2C19（CYP2C19）的作用最重要［1］。CYP2C19酶由490个氨基酸组成，该酶在多种组织器官中均有分布，肝脏为主，参与多种药物的体内代谢［2］。CYP2C19基因多态性对CYP2C19酶活性起着决定性作用，基因多态性可影响对氯吡格雷活性的转化能力，从而对临床治疗效果产生影响，表现为药物疗效的个体差异［3］。研究表明，CYP2C19＊1（野生型）、CYP2C19＊2（无功能突变型）、CYP2C19＊3（无功能突变型）为亚洲人群常见等位基因类型［4，5］。本研究目的是建立CYP2C19基因多态性的检测方法（ARMS PCR），并且以 ADP诱导血小板聚集率分析CYP2C19基因多态性与氯吡格雷疗效的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 我院2011年—2012年体检健康人群，无药物过敏史，检测CYP2C19基因型，选择CYP2C19＊1／＊1野生型10例，CYP2C19＊2／＊2 or＊3突变型纯合子10例，CYP2C19＊1／＊2 or＊3突变型杂合子10例。其中男18名，年龄21岁～34岁（28岁±4岁），女12名，年龄20岁～35岁（29岁±5岁）。研究对象受试前2周及受试期间禁烟、酒，并且不服用任何药物。

1.2 基因分型 利用ARMS PCR技术建立CYP2C19基因多态性检测方法，设计特异性引物和探针序列，引物和探针委托生工生物工程（上海）有限公司合成及纯化。样本处理：抽取受试者静脉血3 m L，EDTA抗凝，利用基因组提取试剂盒纯化核酸，基因组提取试剂盒购自北京天根生化公司，按照其说明书操作。Taq酶扩增系统购自上海Promega公司。反应条件：95℃预变性3 min；95℃预变性15 s，60℃退火、延伸、信号采集40 s，40个循环。反应仪器：Mx3000荧光定量PCR仪，购自美国Agilent公司。基因分型结果由基因测序进行验证。

1.3 ADP诱导的血小板聚集率分析 受试者在第1天（300 mg）、第2天（75 mg）、第3天（75 mg）早饭前空腹服用氯吡格雷，并分别于首次服药前和服药后4 h采集静脉血3 m L，枸橼酸钠抗凝。氯吡格雷购自法国赛诺菲-圣德拉堡制药公司。采血后随即进行血小板聚集率分析。ADP购自美国Sigma公司，反应浓度为5μmol／L，MPG-3型多功能血液凝聚仪购自上海斯隆医电公司。

1.4 统计学处理 使用SPSS 11.0软件对数据进行统计，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，同一基因型服药前后血小板聚集率比较采用配对t检验，不同基因型之间血小板聚集率比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因分型 采取受试者全血样本进行CYP2C19基因多态性分型，选择CYP2C19＊1／＊1野生型10例，CYP2C19＊2／＊2 or＊3突变型纯合子10例，CYP2C19＊1／＊2 or＊3突变型杂合子10例进行血小板聚集率分析研究。分型结果利用基因测序确认，二者一致。

2.2 ADP诱导的血小板聚集率分析 通过对受试者服药前后ADP诱导的血小板聚集率进行分析，3组CYP2C19基因型个体服药前ADP诱导的血小板聚集率差异无统计学意义（P＞0.05），服药后3组个体均较服药前明显降低（P＜0.01），其中CYP2C19＊1／＊1野生型组服药后聚集率明显低于CYP2C19＊1／＊2 or＊3突变型杂合子和CYP2C19＊2／＊2 or＊3突变型纯合子（P＜0.05），CYP2C19＊1／＊2 or＊3突变型杂合子与CYP2C19＊2／＊2 or＊3突变型纯合子差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 ADP诱导的血小板聚集率分析（±s） %

表1 ADP诱导的血小板聚集率分析（±s） %

CYP2C19基因型 n 服药前 服药后CYP2C19＊1／＊1 10 65.4±7.3 27.6±4.1 CYP2C19＊1／＊2 or＊3 10 67.3±9.0 31.5±2.7 CYP2C19＊2／＊2 or＊3 10 65.8±7.0 34.0±3.4

3 讨 论

氯吡格雷是一种常用的血小板聚集抑制剂，临床疗效显著，备受关注。氯吡格雷临床效果存在明显的个体差异，实验室检测ADP诱导的血小板聚集率降低不显著，未能达到预期的抗血小板作用，被称为“氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）”。国外研究约20%的用药者疗效不佳［6］。导致氯吡格雷临床效果个体差异的主要因素是CYP2C19基因多态性，该基因编码的酶作用于氯吡格雷前体的活性转化。其中CYP2C19＊1／＊1基因型转化效率最高（强度代谢，EM），CYP2C19＊1／＊2 or＊3突变型杂合子次之（中度代谢，IM），CYP2C19＊2／＊2 or＊3突变型纯合子最差（弱代谢，PM）。东亚人群弱代谢突变型分布频率（20%）远高于高加索人群（3%～5%）［7］。

基因多态性分析的方法有基因测序、限制性内切酶酶切片段长度多态分析法（RFLP）和ARMS PCR等。基因测序是基因分析的“金标准”，但操作复杂，仪器昂贵。限制性内切酶酶切片段长度多态分析法同样操作步骤多，易污染，灵敏度低。ARMS PCR操作简便、快捷，灵敏度高，对实验室要求较低，适合基层医院的使用。本研究基于ARMS PCR技术，建立了CYP2C19基因多态性分析方法。并且经基因测序验证，二者的检测结果完全一致。

ADP诱导的血小板聚集率分析结果显示，3组CYP2C19基因型个体服药前ADP诱导的血小板聚集率差异无统计学意义（P＞0.05），服药后3组个体均较服药前明显降低（P＜0.01），其中CYP2C19＊1／＊1野生型组服药后聚集率明显低于CYP2C19＊1／＊2 or＊3突变型杂合子和CYP2C19＊2／＊2 or＊3突变型纯合子（P＜0.05），CYP2C19＊1／＊2 or＊3突变型杂合子与CYP2C19＊2／＊2 or＊3突变型纯合子差异无统计学意义（P＞0.05）。CYP2C19＊1／＊1，CYP2C19＊1／＊2 or／＊3，CYP2C19＊2／＊2 or＊3基因型个体服用氯吡格雷的疗效逐步降低，进一步证明了遗传因素对药物效果的影响。

综上所述，本文建立了一种CYP2C19简便快捷的基因分型方法，进一步证实了CYP2C19基因型与氯吡格雷疗效个体化差异的关系，彰显了药物基因组学分析的重要性。通过对受试者基因分型检测，判定受试者的药物代谢速率类型，从而辅助医生合理调整药物剂量，提高药物的有效性，这也符合个体化医学发展的趋势。

［1］ Kazui M，Nishiya Y，Ishizuka T，et al.Identification of the human cytochrome P450 enzymes involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its pharmacologically active metabolite［J］.Drug Metab Dispos，2010，38（1）：92-99.

［2］ Wilkinson GR.Drug metabolism and variability among patients in drug response［J］.N Engl J Med，2005，352（21）：2211-2221.

［3］ Damani SB，Topol EJ.The case for routine genotyping in dual-antiplatelet therapy［J］.J Am Coll Cardiol，2010，56（2）：109-111.

［4］ Xie HG，Kim RB，Wood AJ，et al.Molecular basis of ethnic differences in drug disposition and response［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2001，41：815-850.

［5］ Beitelshees AL，Horenstein RB，Vesely MR，et al.Pharmacogenetics and clopidogrel response in patients undergoing percutaneous coronary interventions［J］.Clin Pharmacol Ther，2011，89（3）：455-459.

［6］ Snoep JD，Hovens MM，Eikenboom JC，et al.Clopidogrel nonresponsiveness in patients undergoing percutaneous coronary inter-vention with stenting：A systematic review and meta-analysis［J］.Am Heart J，2007，154：221-231.

［7］ Tazaki J，Jinnai T，Tada T，et al.Prediction of clopidogrel low responders by a rapid CYP2C19 activity test［J］.J Atheroscler Thromb，2012，19（2）：186-193.