黑龙江省野生猕猴桃资源保护技术研究概况

贾兰虹，张雪岩，刘丽艳，李希才，孙晓丹

(1.黑龙江省农业科学院园艺分院，黑龙江 哈尔滨 150069； 2.黑龙江省农业科学院生物技术研究所，黑龙江 哈尔滨 150086；3.苇河林业局青山林木种子园，黑龙江 尚志 150628； 4.黑龙江大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080)

我国是猕猴桃资源大国，全世界猕猴桃属植物共有54个种, 21个变种, 75个分类群，我国就分布52个种，73个分类群[1]。在黑龙江省境内有3个种，分别是软枣猕猴桃[Actinidia arguta(Siebold & Zucc.) Planch. ex Miq.]、狗枣猕猴桃[A.kolomikta(Maxim. & Rupr.) Maxim.]和葛枣猕猴桃[A.polygama(Siebold & Zucc.) Maxim.]，生长在张广才岭、老爷岭、完达山、小兴安岭和长白山脉。三种野生猕猴桃是珍贵的爬藤野生果树，野生果是可直接食用的山珍，味美香甜，天然维生素C、多酚、总黄酮及微量元素Mn、Fe等含量均高于美味猕猴桃[2-3]，并富含蛋白质、糖、果酸、淀粉和果胶等[4]。随着生态旅游发展，人们涌向林区，品食野味兴趣变得强烈。为保护自然居群雌株数量和天然杂交育种体系完整性不被破坏，必须尽快建立起保护利用技术体系和预警机制，动态监测资源消长，鉴定评价野生猕猴桃优异性状，建立种质库，大规模选种栽培，减轻野生资源的压力。

1 RAPD分子标记[5]

2011-2012年分别对来自黑龙江省境内野生猕猴桃7个主要居集地的软枣6个居群48份；狗枣6个居群66份；葛枣1个居群2份，共计116份材料进行RAPD标记分析。48份软枣中，宾县4份，五常12份，海林2份，苇河16份，平山7份，牡丹江5份；66份狗枣中，牡丹江5份、伊春33份、宾县1份，五常7份，平山16份，海林4份，只有五常可采集到葛枣仅2份。三种猕猴桃可在同一地采集到的只有五常，而伊春、牡丹江牡丹峰只有狗枣，苇河只有软枣。见表1。

表1 野生猕猴桃种质资源采集

RAPD反应体系用30个引物对116个样本进行扩增，只有1个没有扩增产物，29个引物(96.7%)扩增了全部样本，其中12个引物扩增了93.4%样本。结果显示，不同来源的居群有着丰富的DNA谱带，以软枣为例，基因型丰富(图1，图2，图3)。从植株形态和收集到的果实变异类型也证实了这一点。

1宾县，2苇河，3五常，4哈尔滨，5牡丹江，6海林

1宾县，2苇河，3五常，4哈尔滨，5牡丹江，6海林

1宾县，2苇河，3五常，4哈尔滨，5牡丹江，6海林

2 蛋白质组学研究[6]

对采集的果实进行可溶性固形物含量、果实硬度、重量的贮藏变化测定。参照王清等方法[6]提取软枣猕猴桃果实蛋白质。用2D-Quant试剂盒进行蛋白质定量，等电聚焦电泳和SDS-PAGE分离，并在果实后熟生理学的关键拐点进行与后熟相关的蛋白质组学研究，以明确蛋白差异表达与重要生理过程如乙烯的自我调控和信号传导、果实软化机理、呼吸代谢和膜脂过氧化等关键蛋白的关系。蛋白质组学已成为研究果实成熟衰老过程中蛋白差异表达的主要技术方法, 已应用于番茄、桃、葡萄、柑橘、草莓、苹果等果实成熟衰老的分子机理研究[8]。对软枣猕猴桃果实成熟过程及采后后熟蛋白质组学研究尚无报道。软枣猕猴桃果实采收后，最大的问题就是贮藏时间短，常温下放置2～5 d，果实软化。4 ℃时可贮20～25 d。采收时期，采后温度等均影响果实生理硬度。试验在软枣猕猴桃果实采后后熟生理学的拐点即，可溶固形物开始升高(图4)、果实硬度开始下降时(图5)，对果皮，果肉进行蛋白质全息制备。通过等点聚焦(IEF)及聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)双向电泳技术，得到各阶段蛋白质组图像，总蛋白的2-DE分离集中在pH4～7范围内，样品经银染后得到476个蛋白点，并且可以看出蛋白在等电点和分子量2个方向都得到了较好的分离。图6。

图4 软枣采后4 ℃贮藏可溶性固形物含量升高曲线

图5 软枣4 ℃贮藏果重下降曲线

差异表达蛋白点的质谱定量分析，发现果实36 个蛋白差异表达有明显变化(Ratio≥1.2)，这些蛋白分别参与了基础代谢、次级代谢、乙烯合成以及温度胁迫反应, 其中ACC氧化酶变化最为显著。根据蛋白点信息的数目、大小、强弱，检测、鉴定和统计分析，为下一步确定拐点关键酶种类及含量打下基础。

图6 软枣猕猴桃果实蛋白质300 μg 样品2-DE 图谱

3 野生猕猴桃原生境保护，资源状况动态监测

黑龙江省是农林大省，森林是国家生态环境建设和保护的重点区域， 已建设国家级自然保护区24个，省部级自然保护区7个，生物多样性得到加强。40个林业局分别位于黑龙江省中部、北部和东南部的小兴安岭、张广才岭、老爷岭和完达山林区，3种猕猴桃分布其中。一些珍贵树种和动物被列为国家和省级保护对象。从保护森林生态环境出发应用了地理信息管理系统[9]但很多具有重要科研和经济价值的野生资源并未列入国家或省级保护种类中，个体数量处于渐危或濒危状态。野生猕猴桃属植物整体受国家保护，但猕猴桃是雌雄分株植物，以居群或个体在自然界中存在，最有绝迹的危险。软枣猕猴桃为渐危植物，葛枣猕猴桃为稀有植物[10]。2011-2012年在黑龙江省境内野生猕猴桃7个主要居集地对133株进行了GPS定位，对其中116株进行了基因型分析，并建立起资源库，将分子标记成果并入国家数据库，依靠国家基础研究实力，建立优异基因发掘利用的技术体系。把自然生境的野生猕猴桃列入省重点保护野生植物资源调查和小种群野生植物拯救保护工程规划，并建立起预警机制。

4 野生猕猴桃种质异位保护研究

野生猕猴桃一直被认为是有开发前景的浆果之一。1981年黑龙江省农科院园艺分院开始进行寒地野生果树资源收集工作，其中包含3种猕猴桃。2000年在黑龙江省苇河林业局青山林木种子园建成野生软枣猕猴桃异位园收集了662种优株，占用山地11 000 m2，以茶条槭作伴生树[11]，保持着半野生状态，经分子标记分析，基因型丰富，多态性高，已成为珍贵的软枣猕猴桃基因库(图1、图2、图3)。对来自宾县、五常、海林、哈尔滨和牡丹江的野生猕猴桃，经分子标证实也是珍贵的基因资源。将这些材料植入猕猴桃种质圃形成圃位-原位-异位三重形式保护资源，作为目标种质进一步研究。

5 天然杂交分离群体构建研究

猕猴桃是雌雄异株植物，育种改良至今存在优异父本选择的难度问题。通常把在天然群体中优选作为便捷的育种途径。但是，自然优株实属稀有，在当今开放的山林中更是罕见，人工选育亲本杂交育种方法不能不成为今后的育种方向。掌握猕猴桃的遗传规律培育新品种，虽然要花费几十年时间，但确是可永久保持资源大国的地位，掌握更多次生资源。本文采用经过较严格筛选的10个来自野外天然杂交的不同果型变异，以单个果实的种子，获得了9个实生分离群体，群体数量为55～113株。确定了以常规育种方法选出雌雄优株材料，结合分子育种培育新品种的方向。

6 居群恢复与保育

黑龙江省林业在山林抚育管理中，一度偏向保护用材树种，把藤本植物当作影响用材树种生长的非目的树种清掉，是野生猕猴桃居群种数减少主要原因。此外，各林区开发了旅游产业，野生果树资源遭到破坏。从野生资源调查中看到，在靠近公路网的山林和近山中野生猕猴桃踪迹消失，山林中雌雄株比例明显失调。雌株数量消减，已危及种群的存在。天然基因库遗传多样性下降，意味着资源枯竭。所以，在资源发掘同时，建苗圃繁育苗木，进行资源补充和保育，尝试在原位进行种群增加和恢复。

7 讨 论

黑龙江省野生猕猴桃资源调查研究断断续续已有40多年的历史，研究基础依然薄弱，近年来，虽然已明确这3种资源基因型丰富，具有遗传多样性，但，至今仍没有得到真正意义上的保护利用，主要原因是选育品种技术复杂，时间长，开展人工杂交存在父本优选难，杂种苗雌雄鉴别尚无有效技术手段[12]，靠常规育种要花费几十年乃至上百年时间，如日本和新西兰。在我国，传统的常规育种方法尽管朴实可靠，但仍存在极大盲目和风险性，几乎没有人驻足这一领域。随着科技进步和各种研究平台的搭建，已认识到仅从发现挖掘现有优良野生资源进行栽培，并不能增加资源财富，对遗传规律也无从知晓，只有从分子生物学入手，构建寒地野生猕猴桃基因库，和通过开展与国内外科技合作，采取分子育种与常规育种结合方式，才能解决难题，普及人工栽培，使这一物种资源得到科学地持续发掘利用。

参考文献:

[1] 黄宏文.猕猴桃驯化改良百年启示及天然居群遗传渐渗的基因发掘[J].植物学报,2009，44(2):127-142.

[2] 张岚芝,张先,周美英,等.3种长白山野生猕猴桃营养及功能成分比较[J].延边大学农学学报,2010,32(2):106-109.

[3] 张兰杰,谷昊,随晓慧,等.野生软枣猕猴桃总黄酮含量的测定[J].中国野生植物资源,2005，24(4):49-51.

[4] 王菲，许金光，刘长江.软枣猕猴桃中功能保健成分及其在食品加工中的应用[J].食品工业科技,2010，31(8)：421-423.

[5] 周蓓蓓，朱海军，生静雅,等.DNA分子标记在果树种质资源遗传多样性研究中的应用[J].江西农业学报,2011，23(9):47-50.

[6] 王清，产祝龙，秦国政,等.果实蛋白质组学研究的实验方法[J].植物学报，2009，44(1):107-116.

[7] 张丽，罗海波,姜丽,等.果实成熟衰老过程中蛋白质组学研究进展[J].植物生理学报,2011,47(9):861-871.

[8] Alm R, Ekefjärd A, Krogh M,et al.Proteomic variation is as large within as between strawberry rieties.[J]Proteome Res,2007,6:3011-3020

[9] 杨妖,周绍春,吕忠海,等.黑龙江森工林区野生动物资源、湿地及保护区地理信息管理系统的研究[J].林业科技,2007，32(2)：36-38.

[10] 王永吉,倪红伟,张悦,等.黑龙江省濒危野生植物[J].国土与自然资源研究,1996(2):63-67.

[11] 闫朝福，李希才，王志军，等.软枣猕猴桃矮化及仿高产栽培[J].特种经济动植物，2007,(5)29-30.

[12] 柯辉鹏,李小丹,周玲艳,等.不同猕猴桃品种雌雄植株的AFLP分析[J].仲恺农业技术学院学报,2007,20(3):7-12.