朝鲜淫羊藿药材HPLC指纹图谱研究

陈 婷，王 冰，刘 枞，许 亮

(辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600)

中药淫羊藿为小檗科植物淫羊藿(Epimediumbrevico-rnumMaxim.)、箭叶淫羊藿[Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.) Maxim.]、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim.)、巫山淫羊藿(EpimediumwushaneirseT.S.Ying)或朝鲜淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)的干燥地上部分，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，用于阳痿遗精、筋骨萎软、风湿痹痛、麻木拘挛及更年期高血压等[1-3]。本文对淫羊藿属中的朝鲜淫羊藿药材进行了研究，采用高效液相色谱法建立朝鲜淫羊藿药材的指纹图谱[4]，建立了更可靠的分析方法，为该药材的质量分析提供了实验数据。

通过对朝鲜淫羊藿药材HPLC指纹图谱条件的摸索，确定出分离度最佳的色谱条件，并在此条件下对同一批次朝鲜淫羊藿的指纹图谱进行对照品标定和谱图的分析处理得出该批次朝鲜淫羊藿的相似度，建立该药材的指纹图谱分析方法，为科学评价及有效控制该药材的质量提供可行方法和可靠依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪；电子天平(沈阳龙腾电子有限公司，JD200-3G)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ3200B)；无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司 分析纯)；甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司 分析纯)；乙腈(天津市大茂化学试剂厂 色谱纯)；水(大连娃哈哈饮用水有限公司)；淫羊藿苷对照品、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C(中国食品药品检定研究所)；朝鲜淫羊藿药材采于辽宁新宾，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：乙腈(B)-水溶液(A)，检测波长：270 nm；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL。具体色谱条件见表1[5-8]。

表1 色谱条件

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C对照品适量，加甲醇溶解，加甲醇溶液制成浓度分别为0.160、0.140、0.155、0.175 mg/mL的对照品母液。

2.3 供试品溶液制备

取同一批次朝鲜淫羊藿药材10份，粉碎，过40目筛。分别精密称定药材粗粉2.5 g，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇45 mL，回流提取两次，每次90 min。放冷，合并两次提取液，抽滤，滤液于100 mL容量瓶中定容。取25 mL溶液于蒸发皿中蒸干，用甲醇定容于25 mL容量瓶中。取2 mL溶液于10 mL容量瓶中定容，样品溶液经微孔滤膜(0.45 μm)滤过，备用。

2.4 HPLC色谱测定法

分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，同法测定，即得。对照品及供试品图谱见图1。

A.对照品谱图 B.供试品谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 稳定性试验

取1号样品溶液依次于不同时间(0、2、4、8、12、24 h)进样测定峰面积值，测得淫羊藿苷峰面积的RSD 1.6%，朝藿定A峰面积的RSD 1.5%，朝藿定B峰面积的RSD 1.4%，朝藿定C峰面积的RSD 1.0%，由以上结果得知，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在室温放置24 h稳定。

2.5.2 精密度试验

精密吸取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的混合对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次。淫羊藿苷峰面积的RSD 0.4%，朝藿定A的RSD 0.4%、朝藿定B的RSD 0.5%、朝藿定C的RSD 0.5%。由此结果可以得出，进样精密度结果符合规定。

2.5.3 重复性试验

精密称取1号样品粉末2.5 g，共6份，按2.3项下供试品溶液制备条件进行制备，并按上述色谱条件进行测定。测得淫羊藿苷的平均质量分数为0.55%，RSD 1.24% ，朝藿定A的平均质量分数为0.12%，RSD 1.16%，朝藿定B的平均质量分数为0.18%，RSD 1.30%，朝藿定C的平均质量分数为0.05%，RSD 1.28% 。由以上结果得知，样品的重复性试验结果符合含量测定的方法学要求。

2.6 指纹图谱的建立及分析

2.6.1 供试品测定

在上述色谱条件下，测定10批朝鲜淫羊藿药材在2.3项下的提取液，记录图谱。对10批供试品结果进行分析、比较，典型色谱图见图1中供试品谱图。

分别把10批朝鲜淫羊藿指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统的操作规范(范本2004A)软件，对保留时间5～65 min的色谱峰进行多点校正后，自动匹配，生成朝鲜淫羊藿共有模式(图2)。

图2 10批供试品HPLC指纹图谱

2.6.2 指纹图谱的相似度计算

采用国家药典委员会中药指纹图谱相似度软件2004A计算均值相似度，10批朝鲜淫羊藿药材指纹图谱的相似度分别为0.992、0.984、0.994、0.995、0.998、0.998、0.994、0.998、0.984。表明该批朝鲜淫羊藿较均匀。

3 讨 论

本实验曾对乙腈-水流动相的比例及柱温对分离度的影响进行了考察。通过调整流动相比例及柱温，最终确定乙腈-水梯度洗脱条件为:0～24 min(A:25%→27%)，24～43 min(A:27%→48%),43～63 min(A:48%→80%),63～69 min(A:80%→100%)，柱温25 ℃。在此条件下朝鲜淫羊藿的色谱峰信息量丰富、各色谱峰分离度较好，保留时间适中，峰形良好，满足进行指纹图谱分析的要求，故确定该洗脱系统作为朝鲜淫羊藿的HPLC指纹图谱检测的流动相。

在上述色谱条件下，经与参照物比较，精密度试验、稳定性试验及重现性试验中所得RSD值均小于5%，符合有关高效液相色谱指纹图谱分析方法的方法学考察要求，表明该方法准确可靠，重现性较好。

淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C为淫羊藿属植物共有成分，但其总成分含量在朝鲜淫羊藿中含量较高，且在270 nm下的吸收相对其他峰较好。经与对照品比较，在19～27 min内分离度良好且与对照品相匹配，故在建立朝鲜淫羊藿指纹图谱时将其列入特征峰范围。

将HPLC法绘制的谱图导入中药指纹图谱相似度软件2004A计算均值相似度可知，10份样品的相似度均在0.98以上，且保留时间较稳定，说明该批次朝鲜淫羊藿药材相似度良好，质量较均一。并且在该实验中所建立的指纹图谱条件具有良好的稳定性和可靠性，为朝鲜淫羊藿的质量评价提供了更丰富的信息。

参考文献：

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