无患子水提皂素液发酵精制联产生物表面活性剂槐糖脂

付 尧，赵丹青，朱莉伟，孙达峰，张卫明，蒋建新*

(1.北京林业大学 材料科学与技术学院，北京 100083; 2.南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042)

无患子皂素是一种天然非离子表面活性剂，具有良好的起泡性能，其表面活性物质为三萜皂苷类和倍半萜糖苷类、脂肪油和蛋白质。能有效去除污垢，有良好的清洁能力，并且在一些文献中报道无患子皂素具有抗菌、增白、祛斑、祛痘、防止皮肤病的药用功能[1-4]，可以在各种护肤品中作为天然活性物质的主要成分。

生物表面活性剂是天然表面活性剂的一种, 是微生物在特定条件培养时分泌的具有表面活性的一类代谢产物[5-7]。与化学合成的表面活性剂相比, 生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外,还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、良好的选择性和专一性、能生物降解、生物相溶性好等优点[8]。在食品工业、精细化工、医药和农业等工业方面越来越受到青睐。

丘陵假丝酵母是能够生产生物表面活性剂的菌种，可以利用葡萄糖为碳源，进行发酵，生产槐糖脂，具有较高的产量。

本研究根据无患子水提液中含有较高浓度的纤维二糖和葡萄糖，纤维二糖经酶水解，以水提水解液为底物，接种丘陵假丝酵母和相应的发酵培养基，利用无患子水提溶液中的葡萄糖作为碳源，生产生物表面活性剂槐糖脂，在精制皂素的同时，发酵生产生物表面活性剂，从而达到无患子皂素的精制与高值化利用。

1 材料和方法

1.1 材料

原料与试剂：无患子果皮，产自福建；纤维二糖酶，丹麦Novozymes公司；NaOH，KOH，MgSO4·7H2O，KH2PO4，Na2HPO4·12H2O，均为分析级，浓硫酸，美蓝，无水乙醇，北京化工厂；香草醛，天津津科化工厂；葡萄糖，天津市化学试剂三厂；琼脂，蛋白胨，酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、纤维二糖标准品，美国Sigma公司；丘陵假丝酵母(CGMCC2.1654)，CGMCC为中国普通微生物菌种保藏管理中心。

实验仪器：L-550台式低速大容量离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；手提式不锈钢高压蒸汽消毒器，上海三申医疗器械有限公司；HANGPING FA1004N型电子天平；Eppendoff移液枪100 μL/1 000 μL；HIQ-F160全温振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；JK99B全自动表面张力仪，上海中晨数字技术设备有限公司；SW-CJ-IFD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；MJ-16B-Ⅱ型霉菌培养箱，上海跃进医疗器械厂；Canon Power Shot S80数码相机；PHS-25数显pH计，上海雷磁技术有限公司；Leica CME生物显微镜；UV-2000型紫外-可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；Waters 2695e高效液相色谱仪，美国Waters公司；布氏漏斗；B-260旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DZF-6051型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；2151罗氏泡沫仪，上海隆拓仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配置

固体培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，琼脂20 g/L；

液体培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L；

发酵培养基：KH2PO41 g/L，Na2HPO4·12H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，酵母膏5 g/L。

1.2.2 产表面活性剂菌株的种子培养

丘陵假丝酵母(CGMCC2.1654)株菌株购买时以干细胞形式储存于安瓿管内，在超净工作台中操作，安瓿瓶口在酒精灯上加热，滴加两滴无菌水使安瓿瓶开裂处小口，向瓶内滴加相应的灭菌液态培养基，摇匀，吸取菌悬液 加入到对应的固态斜面培养基中，丘陵假丝酵母于28 ℃培养2天，生长出的菌株作为第一代菌株。

将第一代菌株 接种到固态斜面培养基上，在28 ℃的培养温度下培养2天。挑取第一代斜面上的菌落划线接种到固态斜面培养基上，生长出的菌株作为第二代菌株。

将第二代菌株按照同样的步骤，进行第三代培养，到第三代后菌种性质及形态都趋于稳定，将第三代菌种作为后续培养、发酵的基础菌株。丘陵假丝酵母取2只第三代斜面培养菌株，用灭菌液体石蜡封存，4 ℃冰箱保存。

将第三代菌株接种到液体培养基中，在全自动恒温摇床中震荡培养48 h，制备成种子悬液。具体方法：挑取一环第三代培养的菌株，接到液体培养基中，液体培养基中加入适量玻璃珠，28 ℃，130 r·min-1培养48 h。

1.2.3 菌株的形态观察

将挑取第三代菌株斜面上的菌落，划线到固体平板培养基上进行培养。用平行划线法，选出单菌落菌株。挑取丘陵假丝酵母单菌落大载玻片上，用美蓝溶液进行染色，在生物显微镜下进行细胞的观察，并用相机拍照，记录形态。

美蓝溶液的配置：A液，美蓝0.6 g，溶于30 mL 95%乙醇中；B液，KOH 0.01 g，溶于100 mL去离子水中。使用时A，B溶液进行混合。

1.2.4 无患子水提液底物制备

称取50 g无患子干燥果皮(果皮经粉碎，过20目筛)，加入300 mL去离子水，在60 ℃恒温摇床中以150 r·min-1振动提取4 h。将提取液置于离心机中以3 000 r·min-1离心15 min，收集上层清液，即为无患子皂素水提液。由液相色谱分析其中纤维二糖、葡萄糖等浓度。用10%的NaOH溶液，滴加1～2滴调节溶液pH值为4.8。向溶液加入10 IU纤维二糖酶，45 ℃，180 r·min-1的全温震荡培养箱中进行酶解96 h。在水解酶解过程中，前12 h，每2 h取1次酶解样品，12 h后，每12 h取1次酶解样品。最后将酶解液作为丘陵假丝酵母的发酵底物。

1.2.5 生物表面活性剂发酵

将三角瓶加棉塞、牛皮纸，发酵培养基，去离子水，在121 ℃的条件下灭菌20 min。将三角瓶编号 1，2，3，4、5，每瓶加入30 mL无患子水提皂素酶解液。1号为空白组，不接发酵菌种，不加培养基，加入无菌水，补充体积其他组份相同。2、3、4号组份分别接入2%、5%和8%的丘陵假丝酵母，加入相同体积的发酵培养基。5号为3号的对照组，在接种量为5% 的前提下，补充加入5 g/L大豆油。28 ℃，130 r·min-1的全温震荡培养箱发酵168 h。用高效液相色谱检测发酵液中糖浓度，浓硫酸-香草醛显色法[9]检测发酵液中表面活性物质浓度，全自动表面张力仪测定发酵液表面张力。

2 结果与讨论

2.1 产表面活性剂菌株的种子培养

丘陵假丝酵母在经过三代的培养，菌株形态及活性以完全稳定，可作为实验菌株进行发酵实验。使菌株划线接种到平板培养基，在其适宜的培养基下生长，具体情况见图1。

A：丘陵假丝酵母；B：丘陵假丝酵母结晶紫染色显微观察

丘陵假丝酵母在培养24 h后，培养基表面分布白色膜状物，在培养基上有白色菌落，在培养48 h后，菌体在生长繁盛，生长出大量白色菌体。挑选划线培养尾端的单菌落进行美蓝染色，显微镜观察，见图1B。丘陵假丝酵母细胞呈球状，分散排列，是一种能形成假菌丝、不产生子囊孢子的酵母。

2.2 无患子水提液酶解过程

在向无患子水提液加入纤维二糖酶进行水解酶解后，水提液中的纤维二糖浓度随着水解时间的增长而降低，同时葡萄糖浓度随着水解酶解时间的增长而升高(见图2)。 无患子水提液中初始含有纤维二糖33.75 g/L，在加入纤维二糖酶的酶解后，纤维二糖完全酶解为葡萄糖，溶液中葡萄糖浓度为27.93 g/L，香草醛-浓硫酸法测其中皂素含量为133.6 g/L。在水解的前10 h，酶解速率较快，葡萄糖的转化速率较高，同时纤维二糖浓度在水解前10 h降低最为明显，在后续的水解过程中葡萄糖的转化率趋于平缓。在水解72 h 时，纤维二糖浓度为0 g/L，完全转化为葡萄糖，葡萄糖浓度达到最高，完成酶解过程。

图2 无患子水提液酶法酶解过程糖浓度变化

在水解酶解过程中，水解液的表面张力随时间的变化曲线见图3。无患子水提液的在水解过程中，溶液表面张力呈波动状，但基本维持在57.2 mN/m左右。在水解前10 h，溶液表面张力波动幅度较大，可能原因是在这过程中纤维二糖酶将大量的纤维二糖降解为葡萄糖，溶液中葡萄糖浓度突然增大，而无患子皂素结构中也有糖基。溶液中糖浓度的增大会对无患子皂素的表面张力产生一定的影响，使得表面张力波动幅度较大。而在水解10 h以后，溶液表面张力波动较为平缓，由图2得知，在此时间段，溶液中葡萄糖转化率较低，糖浓度变化较小，对溶液中皂素表面张力影响也较小，所以在水解后期，溶液表面张力比较平缓。在水解过程中，溶液表面张力变化不大，在57.2 mN/m上下浮动，说明纤维二糖酶的酶解对无患子皂素影响不大，皂素性质在酶解过程总保持稳定。同时也说明酶蛋白对无患子皂素性质影响不大，对后续接入菌株进行发酵提供了可能性。

图3 无患子水提液酶解水解过程中表面张力变化

2.3 丘陵假丝酵母发酵生产槐糖脂生物表面活性剂

丘陵假丝酵母在一定的发酵条件下，可以产生槐糖脂类的表面活性物质，能有效降低溶液的表面张力。以无患子水提皂素液为底物，接种菌种进行发酵，发酵液中葡萄糖浓度随发酵时间的变化情况见图4。

图4 丘陵假丝酵母接种量与发酵过程中葡萄糖浓度变化

发酵初始，溶液中葡萄糖浓度为25.33 g/L，空白溶液未接入菌种。接入发酵菌的分别为2%，5%，8%，在接种量为5% 的组份中，补充加入5 g/L大豆油作为对照。在未加入大豆油的组份中，葡萄糖的消耗量随着发酵时间的增长而降低，菌种利用葡萄糖为碳源，进行发酵生产表面活性剂。在发酵的前24 h，反应速率最快，葡萄糖浓度降低幅度较大。在发酵中期，各样品组份发酵速率保持一致，在发酵96 h 时，接种量为2%的组份葡萄糖浓度迅速降低，且低于同时期其他组份，在发酵120 h时，发酵液中葡萄糖浓度完全消耗。接种量为5%和8%的组份中，均在144 h时发酵完毕，发酵液中无残留葡萄糖。在加入大豆油的对照组份中，葡萄糖的消耗量与其他组保持一致，没有明显的降低，说明对于丘陵假丝酵母，主要利用葡萄糖作为碳源进行发酵，而且大豆油的加入，增加了发酵体系中碳源的浓度，延长了发酵时间，使得发酵体系在168 h时完全消耗葡萄糖，完成发酵。适当的菌种接入量即可达到发酵消耗葡萄糖的效果，并且无患子水提液中具有较为丰富的碳源，可以作为丘陵假丝酵母的发酵。

发酵过程中的溶液表面张力变化趋势图见图5。由图中可以看出，在丘陵假丝酵母的发酵过程中，溶液表面张力波动明显，并且在波动中保持降低的趋势。空白的表面张力基本维持在57.512 mN/m，最终表面张力为57.366 mN/m。接种量对溶液的最终表面张力有较小影响，接种量为2%的组份最终表面张力为56.083 mN/m，5%和8%的组份最终表面张力分别为56.112 mN/m、56.172 mN/m。最终溶液表面张力随着接种量的升高而升高，说明在以无患子水提液为底物的发酵体系中，适当的接种丘陵假丝酵母就能达到较好的发酵效果，同时接种量越小，溶液的表面张力值越低。对于额外加入5 g/L大豆油的组分，在发酵24 h～72 h之间，发酵液表面张力迅速下降，说明在此时产生大量表面活性物质，能有有效降低溶液的表面张力。72 h之后，溶液的表面张力也略有升高，但也依旧保持降低的趋势，最终表面张力值为55.399 mN/m。与空白组份对比，接入发酵菌和大豆油，均使溶液表面张力有所降低，且加入大豆油的组份降低最为明显，说明产生表面活性物质较多，有效降低溶液表面张力。

图5 丘陵假丝酵母发酵过程中发酵液表面张力变化

2.4 最终表面活性物质浓度

对发酵结束溶液表面活性物质浓度，采用浓硫酸-香草醛法进行测定，测定结果见表1,可以看出，在经过发酵后，溶液中表面活性物质浓度都有明显的升高，空白组中表面活性物质主要是无患子果皮皂素。在丘陵假丝酵母(CGMCC2.1654)发酵中，最终发酵液的酸性增高，复合酵母发酵液呈酸性的特点，并且与空白相对比，经过发酵，丘陵假丝酵母产生了较多的槐糖脂类表面活性物质，在接种量为5%，添加大豆油的样品组中，最后表面活性物质浓度最高，达到52.58 g/L，浓度升高23.4%。

菌株经过发酵生产的表面活性物质，溶液的表面活性物质浓度升高，表面张力值有所下降，说明无

患子表面活性剂与槐糖脂类表面活性剂可以达到很好的相溶性，并且有一定的增效作用。

表1 发酵结束后发酵液表面活性物质浓度

3 小 结

将丘陵假丝酵母经过三代培养后，接入种子培养基，并观察细胞形态，丘陵假丝酵母细胞呈球状，分散排列。无患子水提皂素液经过纤维二糖酶(加入量为每克纤维二糖底物加10 IU)的酶解后，添加发酵培养基，接入不同量的发酵种子菌种液。在发酵过程中，水提液中的葡萄糖完全消耗，2%接种量，溶液中葡萄糖消耗速率最快，且最终溶液表面活性物质达到52.48 g/L，升高了23.4%，溶液最终表面张力值都明显降低。在精制皂素的同时，利用杂质生产生物表面活性剂。无患子水提皂素液精制与生物表面活性剂转化过程耦合，工艺独创。

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