PA感染与定植中血液PEA变化的研究

傅玉琼 周 伟 熊 彬 湛晓勤*

（四川省泸州医学院附属医院呼吸内科，四川 泸州 646000）

PA感染与定植中血液PEA变化的研究

傅玉琼 周 伟 熊 彬 湛晓勤*

（四川省泸州医学院附属医院呼吸内科，四川 泸州 646000）

目的 探讨铜绿假单胞菌外毒素（PEA）在铜绿假单胞菌肺部感染及定植表达差异的临床价值。方法 SD大鼠180只，随机分为PA（铜绿假单胞菌）感染模型组，PA咽部定植组及生理盐水对照组。观察PA感染与定植中血液PEA变化。结果 肺组织结构正常，定植组与对照组无明显区别，模型组出现了明显肺泡及肺间质水肿、出血、炎性细胞聚集的炎症表现。模型组血液PEA DNA表达在接种后第3、7、11天均明显高于定植组，二者比较存在统计学意义（P均＜0.01）。结论 血清检测有助于对铜绿假单胞菌感染与定植的鉴别诊断，且可预测肺部炎症的程度及预后。

铜绿假单胞菌外毒素；实时荧光定量PCR；感染；定植

铜绿假单胞菌外毒素A（P aeruginosa ExotoxinA，PEA）是铜绿假单胞菌的主要致病物质，通过抑制细胞的蛋白质合成而导致细胞死亡，95 %以上临床分离PA都会分泌这种毒素[1]，其基因高度保守[2]，鉴于PEA具有高表达及高度保守性，本实验通过制作大鼠肺部感染及咽部定植模型并检测血液中PEA表达量的差异，为临床上铜绿假单胞菌的感染和定植的鉴别提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 清洁级健康雄性SD大鼠180只，体质量200～250 g。

1.1.2 PA菌株：由本学院检验科提供分离出的标准铜绿假单胞菌株，用分光光度比色法配成2个麦氏单位浓度 （6×108cFu/mL）。

1.1.3 引物的设计与合成参照GenBank公布的序列：上游引物：5CGAACCTTGGCAGTCTCCTA3：下游引物：5CCGGACCA CTTACACCGATC3。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立：所有动物均事先应用地塞米松抑制免疫3 mg/（kg·d），皮下注射，每日1次，连用7 d。将180只SD大鼠随机分为三组（每组各60只），即模型组：从气管内注入0.4 mL铜绿假单胞菌混悬液（2个麦氏单位浓度 6×108CFU/mL）；对照组：从气管内注入0.4 mL生理盐水；定植组：从鼻腔、咽部滴入相同的菌液浓度0.2 mL。

1.2.2 取材

分别于接种后第3、7、11天取材，经腹腔注射2 %苯巴比妥（30 mg/kg）麻醉后，心脏采血方法处死，无菌取出肺组织。

1.2.3 组织病理学检查：取出右侧肺组织，10 %福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片HE染色，光学下观察。

1.2.4 肺细菌学检查：将左侧肺组织匀浆行培养，取0.1 mL稀释并涂盘培养，计数菌落。

1.2.5 荧光实时定量PCR检测：①提取左侧肺组织匀浆DNA；②FQ2 PCR反应体系定量检测DNA。

1.2.6 使用SPSS13.0软件对数据进行处理，数据用均数±标准差（）表示，统计学方法采用重复测量方差分析进行统计描述。P＜0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 细菌培养结果：模型组在接种后第3、7天PA菌落数均＞106cfu/mL，第11天＞104cfu/mL；定植组咽拭子在第3、7天培养均能见大量PA生长，第11天细菌数量较前有所减少；定植组及对照组肺组织未见PA菌生长。2.2 肺组织病理学：光镜下，对照组肺组织结构正常，定植组与对照组无明显区别，未见明显的肺泡间隔水肿、炎性细胞浸润。模型组在3个时间点均有明显病理改变，在接种后第3天都出现了明显肺泡及肺间质水肿、出血、炎性细胞聚集的炎症表现；第7天炎性细胞浸润有所减少，肺泡水肿减轻；第11天炎性细胞较前明显减少，淋巴细胞出现，肺泡腔扩大，间隔增宽。

2.3 FQ-PCR目的片段扩增

2.3.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1所示，可以观察到位于200 bp与150 bp间有一特征条带，无其他非特异性扩增的条带。

2.3.2 标准曲线的绘制：梯度稀释DNA模板，在Rotor-Gene 3000上进行SYBR Green I荧光定量PCR，软件自动生成扩增曲线（如图2）和标准曲线。由构建的标准曲线可见，起始模板浓度与CT值间有良好的线性关系（R2分别为0.9992、0.9989）。

图1 PEA基因片段pcr扩增

图2 PEA扩增曲线

3 讨 论

由于本实验中使用免疫抑制剂，使进入肺内的细菌不断繁殖及毒素产生，引起组织破坏严重。接种后第3天细菌数量多、毒力强，机体免疫功能低下，以多核白细胞浸润为主。多核白细胞是PA肺部感染早期主要的炎性细胞，其在清除病原体的同时也导致肺损伤。同时肺部PA感染时，能诱导体内炎性细胞因子表达增加，引起趋化肽释放，细胞因子有相互促进的作用，升高的细胞因子又加重肺组织损伤，还可使内皮细胞活化而导致血管通透性增加，肺泡腔内炎性渗出增加，使炎性反应链增强，细菌及毒素入血增加进一步刺激细胞因子分泌，加重肺部炎症。随着时间延长，被抑制的免疫逐渐恢复，PA在体内被吞噬细胞清除，使存留在肺内的细菌数量减少，肺部炎症减轻同时炎性细胞因子释放减少，肺部损伤减轻，故在感染后第7天PEA DNA的表达量较第3天降低，第11天最低。因而我们可以检测PEA DNA的水平，依靠这种差异有助于铜绿假单胞菌感染与定植的鉴别。由此我们通过检测PEA DNA表达量的不同可以将感染与定植区分开，为临床鉴别诊断PA感染及定植提供有力的实验依据。

[1] 佟 伟,吴囡,李会.铜绿假单 胞菌外毒 素A原核表 达载体 的 构建 及鉴定[J].现代预防医学,2008,35(12):2317-2318.

[2] 郭生玉,李胜岐.铜绿假单 胞菌感染豚鼠后生物 被 膜形成的研 究[J].中华微生物和免疫学杂志,2003,23(4):292-295.

Study on PEA in the Blood in Detection and Differential Diagnosis of PA Infection and Colonization

FU Yu-qiong, ZHOU Wei, XIONG Bin, ZHAN Xiao-qin*
(Department of Respiratory Medicine, The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China)

Objective To investigate the pseudomonas aeruginosa exotoxin (PEA) in pseudomonas aeruginosa lung infection, and the clinical value of engraftment expression differences. Methods 180 SD rats, were randomly divided into PA(pseudomonas aeruginosa) infection model group, PA pharyngeal engraftment group and normal saline control group. Observation of PA infection and engraftment of PEA changes of blood. Results The structure of normal lung tissue, engraftment group and the control group, no significant difference between model group and there is an obvious alveolar pulmonary interstitial edema, hemorrhage and inflammatory cell aggregation of inflammation. Model group blood PEA DNA expression in 3, 7, 11 days after inoculation were significantly higher than that of engraftment group, which shows there is statistical significance(P＜0.01). Conclusion Serum helps to pseudomonas aeruginosa infection and engraftment, the differential diagnosis of the degree and the prognosis of lung inflammation and predictable.

Pseudomonas aeruginosa exotoxin; Real-time fluorescent quantitative PCR; Infection; Engraftment

R563.1

：B

：1671-8194（2014）01-0010-02

*通讯作者:E-mail: 490546615@qq.com