菱花粉生活力测定方法研究

李双梅，柯卫东，彭静，李峰，钟兰，孙亚林

（武汉市蔬菜科学研究所，430065）

菱花粉生活力测定方法研究

李双梅，柯卫东，彭静，李峰，钟兰，孙亚林

（武汉市蔬菜科学研究所，430065）

为了探索菱花粉生活力的最佳测定方法，以孝感红菱花粉为试材，利用无机盐培养法、MTT（四甲基噻唑蓝）染色法和TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法对花粉生活力进行测定。研究结果表明，培养基中添加低浓度的蔗糖和硼酸对菱花粉的萌发有促进作用，菱花粉萌发的最适培养基为10%蔗糖+0.005%硼酸，萌发率达65.9%；用MTT染色法和TTC染色法测定菱花粉生活力，染色率仅为36.9%和27.1%，效果不理想。

菱；花粉；生活力；萌发率

菱（Trapa spp.），别名菱角、龙角、水粟等，为菱科菱属一年生水生草本植物，起源于欧洲和亚洲的温暖地区[1]，中国是菱的原产地之一[2]。菱在中国的分布范围较广，中国长江流域及其以南各省、自治区均有栽培。

研究菱花粉生活力对杂交育种及种质创新有重要意义。目前，国内学者在菱的分类[3]、形态学[4]、细胞学[5]、生理生化[6]、栽培技术[7]等方面做了大量工作，在菱属植物传粉生物学方面也有少量研究[8]，而有关适宜菱花粉生活力测定方法的研究却未见报道。花粉生活力测定的方法很多，主要有显微镜形态观测法、染色法、培养基发芽法等[9]。本文采用无机盐培养法、MTT染色法和TTC染色法对孝感红菱花粉生活力进行测定，以期找到菱花粉生活力测定的最佳方法，为菱的杂交育种及种质创新提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2012年8月在国家种质武汉水生蔬菜资源圃采集孝感红菱萼片刚开裂的花蕾。剥取花药，放入培养皿中，置于（25±1）℃的电热恒温箱中培养4～5 h，收集花粉备用[10]。

1.2 花粉生活力的测定方法

①无机盐培养法 无机盐基液的配制参照胡适宜[11]的方法。取硼酸（H3BO3）0.1 g、硝酸钙（Ca（NO3）2·4H2O）0.3 g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.1 g、硝酸钾（KNO3）0.1 g，配制成100 mL无机盐基液。设5%、10%、15%、20%、25%、30%6种不同质量分数蔗糖和0、0.005%、0.01%、0.015%4种不同质量分数硼酸的完全随机试验，共24个处理，A，5%蔗糖；B，5%蔗糖+0.005%硼酸；C，5%蔗糖+0.01%硼酸；D，5%蔗糖+0.015%硼酸；E，10%蔗糖；F，10%蔗糖+ 0.005%硼酸；G，10%蔗糖+0.01%硼酸；H，10%蔗糖+0.015%硼酸；I，15%蔗糖；J，15%蔗糖+0.005%硼酸；K，15%蔗糖+0.01%硼酸；L，15%蔗糖+0.015%硼酸；M，20%蔗糖；N，20%蔗糖+0.005%硼酸；O，20%蔗糖+0.01%硼酸；P，20%蔗糖+0.015%硼酸；Q，25%蔗糖；R，25%蔗糖+0.005%硼酸；S，25%蔗糖+0.01%硼酸；T，25%蔗糖+0.015%硼酸；U，30%蔗糖；V，30%蔗糖+0.005%硼酸；W，30%蔗糖+0.01%硼酸；X，30%蔗糖+0.015%硼酸。取少量菱花粉于载玻片上，分别加1～2滴上述培养液，将制备好的片子放在垫有二层湿润滤纸的培养皿内，于（25±1）℃条件下培养，3～4 h后观察花粉萌发率。

②MTT染色法 MTT溶液配制参照张研等[12]的方法。称0.5 g MTT于烧杯，溶解于5%蔗糖溶液25 mL中，后装入棕色试剂瓶，置于冰箱中避光保存。取少量菱花粉于载玻片上，加1～2滴配制好的MTT溶液，盖上盖玻片，在室温下放置10 min，然后在Olympus光学显微镜下观察。染成紫色的花粉生活力强，染成淡红色的生活力次之，不能染色的是没有生活力的花粉或不育花粉。

③TTC染色法 取少量菱花粉放到载玻片上，加1～2滴0.5%TTC溶液，搅拌均匀，盖上盖玻片，将其在（35±1）℃电热恒温箱内放置15～20 min。然后在Olympus光学显微镜下观察，被染成红色的花粉生活力强，被染成淡红色的花粉生活力次之，不能染色的花粉为失去生活力的花粉或不育花粉。

以上每种方法观察3个制片，每个制片观察5个视野，分别统计有生活力花粉粒数和无生活力花粉粒数，计算花粉的活力百分率。花粉活力百分率的计算公式为花粉活力百分率（%）=（有活力花粉粒数/总花粉粒数）×100%；花粉萌发率的计算公式为花粉萌发率（%）=（萌发花粉粒数/总花粉粒数）×100%。

2 结果与分析

2.1 不同浓度蔗糖、硼酸对花粉萌发的影响

从表1可看出，在无添加硼酸、5%～30%蔗糖浓度下（处理A、E、I、M、Q、U），花粉萌发率极低，几乎不发芽；在0.015%硼酸、5%～30%蔗糖浓度下（处理D、H、L、P、T、X），花粉萌发率也不高，在2.0%～32.0%；在5%和30%蔗糖浓度下（处理A、B、C、D和处理U、V、W、X），花粉萌发率也很低，在0～39.4%；以10%蔗糖+0.005%硼酸 （处理F）花粉萌发率最高，达65.9%，其次是15%蔗糖+0.005%硼酸（处理J），花粉萌发率达57.9%，再次是10%蔗糖+0.01%硼酸（处理G）和20%蔗糖+0.005%硼酸（处理N），花粉萌发率分别为51.0%和50.5%，表明菱花粉在低浓度蔗糖和低浓度硼酸下萌发率高。综合来看，本试验中以10%蔗糖+0.005%硼酸最适合菱花粉萌发。

2.2 MTT染色法菱花粉生活力的测定结果

通过光学显微镜观察，用MTT染色后，染成紫色和淡红色（有生活力）的花粉占36.9%，不能染色（没有生活力）的花粉占63.1%，测定结果明显偏低于无机盐培养法最佳培养基测定菱花粉的萌发率（65.9%），不能真实反映菱花粉的生活力。因此，MTT染色法不适宜作为菱花粉生活力的测定方法。

2.3 TTC染色法菱花粉生活力的测定结果

通过光学显微镜观察发现，用TTC染色后，染成红色和淡红色（有生活力）的花粉占27.1%，不能染色（没有生活力）的花粉占72.9%，此方法测定的菱花粉生活力更低。因此，TTC染色法也不适宜作为菱花粉生活力的测定方法。

3 结论与讨论

培养基发芽法是花粉生活力应用较广泛的一种方法，测定结果较精确可靠[13]。有研究认为，在培养基中加入适当浓度的蔗糖和硼酸利于花粉萌发。蔗糖不仅为花粉萌发和花粉管生长提供养分，还维持花粉与培养液之间的渗透平衡，防止花粉和花粉管破裂[14]。硼酸能促进糖的吸收和代谢，与糖结合可以提高花粉的萌发率，增加氧气的含量和吸收，参与果胶物质的合成[15]，有利于花粉管的建造[13]。本文分别采用不同浓度的蔗糖和不同浓度的硼酸进行完全随机试验，结果表明，最适宜菱花粉萌发的培养基为10%蔗糖+0.005%硼酸，萌发率达65.9%。

测定花粉生活力的染色方法除MTT染色法和TTC染色法外，还有I2-KI染色法、醋酸洋红染色法和亚甲基蓝染色法等[9]，不同染色法只适合某些植物花粉生活力的测定[9]。本试验中采用MTT法和TTC法测定菱花粉生活力，染色率均较低，不能真实反映菱花粉生活力，2种方法均不宜用于测定菱花粉生活力，同样也证明了以上观点。相比较而言，MTT染色法稍接近无机盐培养法的测定结果，采用不同时期的菱花粉，选用无机盐培养法和MTT染色法进行比较测定，看是否能找到这2种方法在菱花粉生活力测定上的相关性，有待进一步研究。

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Research on Methods for Pollen Viability Determinationof Water Chestnut

LI Shuangmei,KE Weidong,PENG Jing,LI Feng,ZHONG Lan,SUN Yalin

In order to explore suitable methods for pollen viability determination of water chestnut,the pollen viability of cultivar Xiaoganhongling was determined by using the methods of inorganic salt culture,MTT staining and TTC staining. The results showed that the medium supplemented with low concentrations of sucrose and boric acid could promote the germination of pollen,and the optimum medium for pollen germination was 10%sucrose+0.005%boric acid,with the germination rate of 65.9%.The MTT staining and TTC staining methods were not ideal for pollen viability determination of water chestnut,because their dyeing rates were merely 36.9%and 27.1%.

Water chestnut;Pollen;Viability;Germination rate

S645.4

A

1001-3547（2014）18-0045-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2014.18.016

武汉市农科院创新项目“菱传粉生物学及杂交技术研究”（Cx201408）

李双梅（1974-），女，本科，高级农艺师，研究方向为水生蔬菜种质资源研究，电话：027-88116313，E-mail：lishm16@163.com

柯卫东，男，通信作者，推广研究员，研究方向为水生蔬菜种质资源及育种研究，电话：027-88116313，E-mail：wdke63@163.com

2014-08-11