一种酶联免疫检测系统用于米面中真菌毒素检测的效果评价

戚红卷，荣 钊，岳丽君，安代志，靳连群，刘雪林

一种酶联免疫检测系统用于米面中真菌毒素检测的效果评价

戚红卷，荣 钊，岳丽君，安代志，靳连群，刘雪林

目的：评价某品牌数字化食品安全快速检测系统对米面中黄曲霉毒素B1（AFB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及玉米赤霉烯酮（ZEN）3种真菌毒素的酶联免疫检测效果。方法：以从超市随机购买的某品牌大米和面粉作为对象，按照试剂盒说明书开展酶联免疫吸附测定（ELISA）检测，并进行标准曲线线性、各种毒素最低检测限、加标回收率及加标回收精密度等方法学验证。结果：3种毒素标准曲线的线性相关系数均大于0.99；AFB1、DON及ZEN的最低检测限分别为1.69、184及41μg/kg，均低于食品中真菌毒素限量国家标准；平均加标回收率在80%～100%之间，加标回收的相对标准偏差（RSD）在10.0以内。结论：该品牌数字化食品安全快速检测系统及配套试剂盒对米面中真菌毒素检测的样品前处理简单、检测速度快、结果准确性高，具有较强的适用性。

真菌毒素；黄曲霉毒素B1；脱氧雪腐镰刀菌烯醇；玉米赤霉烯酮；酶联免疫吸附测定

0 引言

黄曲霉毒素B1（AFB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及玉米赤霉烯酮（ZEN）同属于真菌毒素，是一类存在于自然界中的由各种真菌产生的有毒次级代谢产物，广泛污染小麦、大米、玉米等谷物籽实、坚果及饲料等植物源性产品。这类物质不仅能导致农产品霉败变质、营养物质损失及产品品质降低，还能通过对人和动物机体内DNA、RNA、蛋白质及各种酶类的合成抑制以及对细胞结构的破坏而引起真菌毒素中毒[1]。AFB1具有强致癌性和强免疫抑制性，当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生；微量持续摄入可造成慢性中毒及生长障碍，引起纤维性病变，导致纤维组织增生[2-4]。DON又名呕吐毒素，由某些镰刀霉真菌属产生，其毒性作用主要表现为影响动物的免疫系统及胃肠道，另外也会导致人出现头痛、头晕、呕吐、腹泻和中枢神经功能紊乱等症状[5-6]。ZEN又称F-2毒素，主要成分为禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等产生的2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，具有很强的生殖毒性及致畸作用，可使家畜特别是猪和羊等发生雌激素亢进症，导致不孕或流产[7]。这些毒素对人及动物的健康构成了严重威胁，我国食品安全相关标准对这类毒素在米面等制品中的限量做了严格规定，一般为几十个ppb至几个ppm范围[8]。

AFB1、DON及ZEN的实验室检测主要采用薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）及液相色谱-质谱联用（LC-MS）等仪器分析方法，这类方法具有高灵敏度和高精度，但是设备昂贵、技术难度大，检测成本高，在实际应用中较难普及[9]。快速检测具有简便、快速和易操作的优势，其中酶联免疫吸附测定（ELISA）是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种免疫分析方法，主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理[10]，操作程序规范、简单，检测灵敏度高，非常适合于真菌毒素的检测。近年来，采用ELISA方法检测真菌毒素的相关论文不断涌现，但大多属于综述类，对实际样品进行检测的技术性论文相对较少，对检测工作者的参考价值和指导性不强。

本文采用某品牌数字化食品安全快速检测系统及配套试剂盒，对米面中的AFB1、ZEN及DON 3种毒素进行了快速检测。该系列试剂盒采用直接竞争ELISA原理，即在酶标板微孔条上预包被二抗，样品中的毒素和该毒素的酶标抗原竞争抗该毒素的抗体，同时抗毒素抗体与二抗结合，经四甲基联苯胺（TMB）底物显色，样本吸光值与其含有的毒素成负相关，与标准曲线比较再乘以相应的稀释倍数，即可得出样品中毒素的含量。本文评价了该系统对米面中3种毒素的检测效果，指出目前存在的问题并提出相应的改进意见。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂材料

1.1.1 仪器与试剂

数字化食品安全快速检测系统（倍肯恒业科技发展有限责任公司），电子天平（感量0.01 g，Mettler Toledo），Centrifuge 5804R台式离心机（Eppendorf），多功能酶标仪（Labsystems Multiscan MS），XW-80A漩涡混合器（海门市其林格尔仪器制造有限公司）；AFB1、ZEN及DON快速检测试剂盒（倍肯恒业科技发展有限责任公司）。

1.1.2 材料

大米、面粉（古船牌，购自超市）。

1.1.3 标准品

AFB1、ZEN及DON标准品（购自Fermentek公司）。

1.2 样品前处理

称取5.0 g粉碎的大米或面粉样本，置于50mL聚苯乙烯离心管中，加入20mL样品提取液，震荡混匀10min；于4 000 r/min离心5min，取1mL上清液，用4mL样品稀释液稀释并涡旋混匀；取稀释后液体上机测定。

1.3 样品检测

1.3.1 试剂回温

将所需试剂及洗涤液从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂在使用前均需摇匀。

1.3.2 编号

取出所需数量的微孔板，将样本和标准品对应微孔按顺序编号，每个样本和标准品做2孔平行试验，并记录标准孔和样本孔所在位置。

1.3.3 加标准品/样本

加标准品或样本50μL/孔至对应的微孔中，加入待检毒素的酶标物50μL/孔，再加入抗试剂50μL/孔，轻轻震荡摇匀，盖板后置于25℃左右的室温环境中避光反应30min。

1.3.4 洗板

小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤液300μL/孔，充分洗涤5次，每次间隔30 s，用吸水纸拍干微孔板。

1.3.5 显色

依次加入底物溶液A和B各50μL/孔，震荡混匀，室温避光反应20min。

1.3.6 测定

加入终止液50μL/孔，震荡混匀，分别于酶标仪450及630 nm处测定吸光度（OD）值。

1.4 数据处理

采用RidasoftWin软件对测得的数据进行处理。

2 结果

按照样品检测的步骤，测定各个试剂盒自带的系列标准溶液的OD值，以标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，log it为纵坐标，log it=ln（p/q），p=B/B0（B为标准品溶液OD值，B0为0标准品溶液OD值），q=1－p，绘制标准曲线，得到各种毒素的线性方程和相关系数。

2.1 线性结果

2.1.1 AFB1线性结果

AFB1线性方程如图1所示，其中横坐标为AFB1标准品浓度的对数，纵坐标为log it。

图1 AFB1的标准曲线及线性方程

2.1.2 DON线性结果

DON线性方程如图2所示，其中横坐标为DON标准品浓度的对数，纵坐标为log it。

图2 DON的标准曲线及线性方程

2.1.3 ZEN线性结果

ZEN线性方程如图3所示，其中横坐标为ZEN标准品浓度的对数，纵坐标为log it。

图3 ZEN的标准曲线及线性方程

从图1～3可以看出，3种毒素的标准曲线线性相关系数R均在0.99以上，标准曲线线性良好。不足之处是：各毒素的系列标准溶液均是用甲醇或其他溶剂溶解标准品而配制的，难以反映米面等基质的影响。

2.2 最低检测限

以空白实验来确定最低检测限。对20份空白样品进行检测，通过空白样品测定值的平均值加3倍标准偏差计算检测限。3种毒素的最低检测限结果见表1～3。

2.2.1 AFB1最低检测限

AFB1最低检测限见表1。

表1 AFB1最低检测限测定结果μg/kg

2.2.2 DON最低检测限

DON最低检测限见表2。

表2 DON最低检测限测定结果μg/kg

2.2.3 ZEN最低检测限

ZEN最低检测限见表3。

表3 ZEN最低检测限测定结果μg/kg

从表1～3结果来看，AFB1、DON及ZEN的最低检测限分别是1.69、184及41μg/kg。食品中真菌毒素限量国家标准（GB 2761—2011）规定大米及面粉中AFB1的限量值分别为10、5μg/kg，DON的限量值为1 000μg/kg，ZEN的限量值为60μg/kg。本文中AFB1、DON及ZEN的检测限均低于国家限量标准，可以满足要求。

2.3 加标回收试验

以空白的大米及面粉为基质进行AFB1、DON及ZEN的加标回收试验，各种毒素的加标水平见表4～ 6。按照上述的试验方法进行样品处理和测定，计算加标回收率及相对标准偏差（RSD），试验重复6次。以加标回收试验的回收率表示方法的准确度，以加标回收率的RSD表示方法的精密度。3种毒素的加标回收率、平均回收率及RSD分别见表4～6。

2.3.1 AFB1加标回收试验结果

AFB1加标回收试验结果见表4。

表4 AFB1加标回收试验结果

2.3.2 DON加标回收试验结果

DON加标回收试验结果见表5。

2.3.3 ZEN加标回收试验结果

ZEN加标回收试验结果见表6。

从回收率结果可以看出，米面中3种毒素的平均加标回收率均在80%～100%之间，RSD在10.0%以内，这说明ELISA法测定米面中AFB1、DON及ZEN的重复性良好，回收率可以满足米面中真菌毒素快速检测的要求。

表5 DON加标回收试验结果

表6 ZEN加标回收试验结果

3 讨论

由于ELISA具有样品前处理简便、快速准确、所需仪器廉价等优点，已广泛应用于免疫学检验的各领域中。国家标准 GB/T 5009.22—2003及 GB/T 5009.111—2003规定了ELISA方法作为粮食行业中AFB1及DON检测的标准方法之一。影响ELISA试验结果的因素很多，如：试剂盒使用时没有恢复到常温、洗板操作不规范、加样不均匀及显色时间控制不好等，故需加强各个环节的质量保证才能充分发挥其优点。尤其是ELISA结果的准确性在很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA操作程序的要点。洗板过程中要注意以下因素：（1）洗涤液在不溢出的前提下尽量多加，这样洗涤效果更好；（2）加入洗涤液后，用手指或笔杆等从不同侧面轻轻敲击微孔架数次，以保证洗涤效果；（3）甩板过程很容易造成微孔之间相互污染，因此甩板手势和力度要合适，既要保证一次性甩出完全，又要避免用力过猛将微孔从微孔架上甩出脱落，同时还要注意避免甩出的液体碰到地面或硬物反弹到微孔中；（4）甩板后观察微孔底部是否有气泡产生，若有气泡，用干净的尖状物品将气泡挑破，以保证加入液与包被物质充分接触。

本试验采用倍肯数字化食品安全快速检测系统及配套ELISA试剂盒测定米面中真菌毒素，试验结果表明：该方法对各种毒素的样品前处理过程简单一致，检测速度快，在保证试剂盒质量及规范操作的前提下，得到的标准曲线线性良好，检测结果准确性高。作为一种快检方法，本文采用的ELISA检测系统对于大批量米面样品中真菌毒素的筛查具有较强的适用性。希望本研究能为从事食品中真菌毒素检测的科研及检测工作者提供参考。

[1] 王希春，何成华，刘海明.真菌毒素的污染，危害及其检测技术[J].畜牧与兽医，2009，41（8）：104-107.

[2] 杨丰利，汤蕾妍，何宝祥.黄曲霉毒素脱毒方法的研究进展[J].广西畜牧兽医，2006，22（5）：223-225.

[3] 汪小舟，祝阳.黄曲霉素的毒害及防除[J].现代食品科技，2000，21（2）：223-224.

[4] 宫春波，姜连芳，张永翠.黄曲霉毒素在食品中的危害及去除方法[J].食品研究与开发，2004，25（1）：120-121.

[5] HE C，FAN Y，ZHANG H，et al.Isolation and identification of a strain of aspergillus tubingensiswith deoxynivalenol biotransformation capability[J].Int JMolSci，2008（9）：2 366-2 375.

[6] 陈丽星.真菌毒素研究进展[J].河北工业科技，2006，23（2）：124-126.

[7] Vinod K，Basua M S，Rajendran T P.Mycotoxin research and mycoflora in some commercially important agricultural commodities[J]. Crop Protection，2008，27（6）：891-905.

[8] GB 2761—2011 食品安全国家标准食品中真菌毒素限量[S].

[9] 尹珺，张洪英，张海彬.脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）理化检测方法的研究[J].畜牧与兽医，2006，38（10）：6-8.

[10]马颀，任珊，许美玉.酶联免疫吸附技术在食品安全检测中的应用[J].食品科技，2008（1）：200-204.

（收稿：2013-11-13 修回：2014-01-07）

Effect evaluation of one ELISA system for cerealsm ycotoxins detection

QIHong-juan1,RONG Zhao2,YUE Li-jun1,AN Dai-zhi1,JIN Lian-qun1,LIU Xue-lin1
(1.Institute for Disease Prevention and Control of the PLA,Beijing 100071,China; 2.Beijing Biochem Hengye Science&Technology Development Co.,Ltd.,Beijing 102200,China)

Objective To evaluate the effects of one ELISA module of Digital Food Safety Rapid Testing System from some company for the detection of Aflatoxin B1(AFB1),deoxynivalenol(DON)and zearalenone(ZEN).Methods Some rice and flour randomly purchased from the supermarket were chosen as the subjects,and detected according to the instructions to validate themethodologies,which included the linearity of the calibration curve,limit of detection(LOD),the recovery and its precision.Results The linear correlation coefficients for the three mycotoxins were all larger than 0.99. LOD of AFB1,DON and ZEN was 1.69,184 and 41μg/kg,respectively,and LOD of threemycotoxins was all lower than theirminimum allowable concentrations in national standards.The average recovery was from 80%to 100%,with the relative standard deviation（RSD）less than 10.0.In addition,the procedure of pretreatmentwas simple.Conclusion The digital food safety rapid testing system and relevant kits from some company are suitable for determination ofmycotoxins in cereals.[Chinese Medical Equipment Journal，2014，35（8）：75-78]

mycotoxin;aflatoxin B1;deoxynivalenol;zearalenone;ELISA

R318；TH776

A

1003-8868（2014）08-0075-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2014.08.075

北京市自然科学基金项目（8112027）；军队后勤科研计划重点项目（BWS12J043）

戚红卷（1977—），男，博士，助理研究员，主要从事军队饮水与食品卫生方面的研究工作，E-mail：qihj115@163.com。

100071北京，中国人民解放军疾病预防控制所（戚红卷，岳丽君，安代志，靳连群，刘雪林）；102200北京，北京倍肯恒业科技发展有限公司（荣钊）

刘雪林，E-mail：liuxue2020@live.cn