八角莲不同部位鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素含量的测定

马志刚,郑永雯,冯益青,王沛霖,杨保涛,邵娅婷,刘彦雄,曹秋娥

(云南大学 化学科学与工程学院 教育部自然资源药物化学重点实验室，云南 昆明 650091)

鬼臼毒素是八角莲、桃儿七、山荷叶等小檗科多年生草本类群鬼臼亚科属植物中的重要活性成分,具有抗肿瘤、抗癌、抗病毒和免疫调节作用等功能,尤其是在抗癌方面发挥了重要的作用[1-4].4′-去甲鬼臼毒素是鬼臼毒素衍生物之一,既具有抗癌活性且毒副作用小等优点,也是重要的抗癌药物如VP-16和VM-26结构改造的前体.因此对鬼臼毒素类物质的研究包括对其含量的测定引起了广泛的关注.

目前,测定鬼臼毒素含量的方法主要有光度法[5]、荧光法[6]、高效毛细管电泳[7]和高效液相色谱法[8-12].这些已有的报道方法各有其不同的特点,但都没有涉及鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素的同时分离测定.用反相高效液相色谱法,建立了一个同时分离测定鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素的方法,并以此方法对八角莲不同部位中4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的含量进行了研究,结果在八角莲的叶、茎、须和根中都没有检测到4′-去甲鬼臼毒素,但都检测到了鬼臼毒素,而且发现,鬼臼毒素的含量在根部最多,而在叶中的含量最少.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters1525-HPLC色谱仪带，Waters2996 PAD二极管阵列检测器，Waters717plus Autosampler自动进样器，Empower中文色谱工作站.

标准对照品鬼臼毒素(PPT)和4′-去甲鬼臼毒素(DMEP)均为Sigma公司产品.八角莲样品采自云南省玉溪地区野生珍稀植物栽培区.色谱分析用溶剂为色谱纯,其它试剂均为分析纯,实验用水为超纯水.

1.2 对照品溶液配制

储备液鬼臼毒素(1.500 mg/mL)和4′-去甲鬼臼毒素(1.000 mg/mL)分别用乙醇配制，4℃下保存.各对照品工作溶液由储备液用乙醇稀释得到.

1.3 样品溶液的制备

准确称取八角莲的叶、茎、须和根各 1.000 0 g，均用50 mL无水乙醇于80 ℃回流提取8 h后，再超声提取30 min，过滤.滤液用旋转蒸发仪在0.06 MPa下减压浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解并定容至10 mL，得样品溶液.所有样品溶液均经0.45 μm微孔滤膜过滤后直接进样分析.

1.4 色谱条件

色谱柱:Waters Spherisorb ODS2 5 μm(4.6 mm i.d.×250 mm)；流动相:甲醇-水混合溶剂(65∶35，V/V)；流速:1.0 mL/min；柱温:40 ℃；检测波长:207 nm；进样量:20μL.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化选择

流动相的组成影响分析的灵敏度、峰的分离度以及分析时间.考察了流动相中甲醇含量变化对4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的保留时间和分离度的影响，结果见图1.可见，4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的保留时间均随流动相中甲醇含量的增大而减小，而两组分的分离度却随甲醇含量的增大先降低后有所增加.为兼顾分离度和分析时间，实验选用了体积比为65∶35的甲醇-水混合溶液作为流动相.

2.2 色谱图

按上述优化的色谱条件得到的标准色谱图见图2.

2.3 方法的线性关系

取乙醇储备液稀释后的的4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素对照品混合物平行进样6次,记录色谱峰面积,以峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标进行线性回归,线性范围和回归方程见表1.

2.4 精密度试验

取同一供试品溶液,分别连续进样6次,计算2个组分的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD),结果见表1.

2.5 重现性试验

取八角莲的茎6份,按样品溶液的制备方法制备成6份,分别进样20 μL，测定峰面积,计算含量,结果鬼臼毒素含量的RSD为3.50%，表明方法重现性良好.

2.6 回收率试验

在各样品提取液中分别加入一定量的4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素对照品,用0.45 μm微孔滤膜过滤后,滤液分别进样20 μL,进行加样回收实验,结果见表2.

2.7 样品测定

采用上述HPLC方法分析八角莲叶、茎、须和根中4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的含量,结果见表2.样品的色谱图见图3.

表1 工作曲线与精密度(n=6)

表2 八角莲不同部位鬼臼毒素和4′-去甲鬼臼毒素的测定结果 (n=6)

注：表中“—”表示未检出.

3 结语

采用甲醇-水为流动相,反相色谱分离模式分离和测定八角莲中4′-去甲鬼臼毒素和鬼臼毒素的含量.测定结果表明，八角莲根、茎、叶和须的乙醇提取物中均未检测到4′-去甲鬼臼毒素，而鬼臼毒素在八角莲的叶、茎、须和根中的分布是不一样的,其中在根部的含量最高，而在叶中的含量则最低,这一结果与文献报道结果是一致的[7].

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