神农香菊花、茎和叶香气成分的组成分析

菅 琳,孙 明,张启翔

(北京林业大学 园林学院 花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室，国家花卉工程技术研究中心，北京 100083)

神农香菊(Chrysanthemumindicumvar.aromaticum)属菊科菊属，多分布在湖北神农架地区海拔1 970～2 830 m的山坡、草甸，生长环境温度低、湿度大、阳光充足且排水良好。神农香菊为多年生草本植物，植株矮小，叶小而厚，深绿色，叶脉隆起；花小，黄色，花期8月中旬至9月上旬。神农香菊是野菊的变种，与野菊的主要区别是其全株具有浓郁的特殊芳香，极具观赏及药用价值。

神农香菊最早由中国科学院武汉植物研究所刘启宏等[1]发现并鉴定，其全株主要化学成分为α-侧柏酮、β-侧柏酮、龙脑等萜类化合物。目前，国内对神农香菊的研究主要集中在精油提取及药用成分方面。王国亮等[2]研究发现，神农香菊干花的精油化学成分主要有脂肪族类、单萜、倍半萜及其氧化物，其中主要成分有丁酸酯类、侧柏酮、乙酸龙脑酯等。Wang等[3]对干燥的神农香菊花、茎、叶中的挥发性成分进行了GC-MS测定后发现，干花中的主要挥发性成分是乙酸龙脑酯(15.40%)和α-水芹烯(14.18%)等，干叶中的主成分为对伞花烃 (20.42%)、乙酸龙脑酯(20.41%)和α-水芹烯(13.67%)等，茎段中主要含有反式-β-金合欢烯 (17.95%)、大根香叶烯(12.89%)和 β-水芹烯 (12.70%)等。龚复俊等[4]利用NMR等波谱手段，在神农香菊干花精油中提取并鉴定了木犀草素、木犀黄酮甙等药用成分。刘朝霞等[5]发现，神农香菊的精油有较强的抗菌活性和氧化能力。

神农香菊浓郁的自然花香在菊科植物中十分少见，具有较大的园林应用潜力，目前，对神农香菊全株自然香气成分的测定尚未见报道。为此，本研究利用静态顶空吸附结合DTD-GC/MS方法对神农香菊花、叶、茎的香气进行了比对分析，以期为进一步推广和应用神农香菊香气性状提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试神农香菊为北京林业大学胖龙温室内的1年生扦插苗，母株于2012-10采自湖北神农架山区瞭望塔处(海拔2 600～3 000 m)，供试植株均长势良好、无病虫害。2013-04将处于花期的神农香菊扦插苗置于温度25 ℃、湿度65%的人工气候箱中预培养1周。

1.2 方 法

1.2.1 挥发物的采集 取活体神农香菊盛花期中上部花8～10朵，植株中上部叶片6～7片和植株地上部1 cm去叶茎段各3 g，备测。

采取顶空吸附技术将花、茎、叶的挥发性气体收集到吸附管中[6-7]，采样时间为上午09:30-10:30。具体步骤如下：(1)将含有200 mg Tenax (60/80 mesh) 的吸附管(CAMSCO，Houston，TX，USA)在100 mL/min氮气的吹扫下于270 ℃活化120 min，吹走其中的内含物。(2)将刚刚离体的新鲜花、茎、叶样品置于采样袋中(Reynolds，406 mm×444 mm，Richmond，VA，USA)，将采样袋用橡胶管夹密封。(3)抽干采样袋内的杂质空气(防止杂质气体干扰)，使袋内瞬时达到近真空状态，再以1 L/min的速度打入1 L经活性炭过滤的空气，待袋中空气约为袋容积的3/4 时，保持袋内气体容量。(4)保持采样袋密闭状态，将其置于25 ℃的日光培养箱中静置40 min。(5)用抽气泵(GSP-300FT-2，Gastec Corporation，Japan)以200 mL/min的速度将含有挥发物的气体抽出，抽样5 min，并将挥发物吸附在吸附管里。(6)用上述方法对花、茎、叶各平行采样3次，同时设定空白对照，仅对空气进行采样分析。(7)采样结束后，将吸附管置于干燥的低温(-20 ℃)环境中保存待测。

1.2.2 挥发物成分的分析 挥发物成分采用直接热脱附法-气相色谱/质谱联用法(Direct thermo desorption/gas chromatography/mass spectrum，DTD-GC/MS)分析。直接热脱附是热脱附法的一种，具有所需样品少、一步完成分离解析的优点[8]。吸附管中的样品在自动热解析器(ATD，automatic thermal desorber，Perkin Elmer Turbo Matrix 650)中加热解析，通过惰性载气将其中的挥发性物质带入气相色谱仪中进行分析。仪器参数设置如下：ATD工作条件：热脱附温度为250 ℃(10 min)，载气氦气的流速为1.5 mL/min；热解析温度260 ℃(10 min)，冷肼迅速加热到300 ℃(40 ℃/s)，进样口温度为250 ℃。GC工作条件：色谱柱为30 m×0.25 mm×0.25 mm的DB-5MS柱；程序升温：起始温度为40℃，保持2 min，然后以6 ℃/min的速度升到180 ℃，再以15 ℃/min的速度升到270 ℃，保持3 min。MS工作条件：电离方式为电子电离源(EI)；电子能量为70 eV；扫描范围为30～500 m/z。

1.3 数据处理

挥发物的鉴定使用Turbo Mass5.4.2 GC/MS软件进行分析。分析得到的总离子流图中的不同质谱峰经NIST08数据库检索后，再将待测成分的保留指数与Pherobase数据库[9]中的标准物进行比对分析，以确定其类别。最后应用峰面积归一法计算出每种组分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 神农香菊花的香气成分分析

从神农香菊花的香气中共分离出79个峰，通过NIST08及Pherobase数据库检索鉴定出72种化合物，包含了98.03%的花香总挥发物成分(表1)。从化合物种类来看，花香气主要由萜烯类化合物组成，共有48种，占总挥发性成分的89.54%，其中，β-侧柏酮的含量最高，占总挥发性成分的65.48%；脂肪酸衍生物共有18种，占总挥发性成分的6.72%；另有少量苯类及苯丙素类化合物。

表1 神农香菊花、茎、叶中的挥发性成分及其相对含量

续表 1 Continued table 1

2.2 神农香菊叶、茎香气成分分析

叶、茎香气成分分析方法与花香一致。与花香成分相比，叶与茎香气成分种类相对较少，分别鉴定出65和66种化合物，与花香中相同的挥发性物质有55种。叶香气中的萜烯类含量及种类与花香相近，相似度>84%，而脂肪酸衍生物种类，尤其是酯类化合物减少，但叶醇含量大大增加。茎香气中萜烯类相对含量较高，占总挥发物成分的94.05%；脂肪酸衍生物等其他物质仅占3.68%。叶香气中萜烯类相对含量为90.21%，香气中含量最高的成分是α-侧柏酮(55.18%)，其他重要成分(>1%)樟脑、β-石竹烯、大根香叶烯、2-甲基丁酸乙酯在花香成分中也占有较大比例。茎中α-侧柏酮和β-侧柏酮含量较高，分别为33.10%和37.02%，其他如樟脑、β-石竹烯、古巴烯、乙酸桃金娘烯酯、γ-杜松烯含量均超过1%。

2.3 神农香菊花、叶、茎的香气释放量

由于花、茎、叶的样品质量相同，在保证采集及分析方法一致的条件下，三者香气释放量的计算可通过GC/MS总离子流图实现。将花、茎、叶分离得到的所有质谱峰面积相加比对各器官香气释放丰度，结果(图1)表明，花朵中香气释放丰度最高(2.67E+10)，茎次之(1.45E+10)，叶片的香气释放量最低(0.766E+10)，这与感官评价结果相符。

图1 神农香菊花、茎、叶香气释放量的比较

3 讨 论

本试验发现，神农香菊花、茎、叶自然香气的主要成分为萜烯类物质。其中α-侧柏酮与β-侧柏酮含量最高，与神农香菊全株及干花精油主成分的测定结果[1-2]相符，而在其他重要成分上的差别可能与干燥及测定方法有关。侧柏酮属单萜类物质，带有类似薄荷的清爽气味，是一种重要的香料成分。研究发现，侧柏酮是河南野菊花精油、菊蒿花香及鼠尾草精油中的主要成分[10-12]。神农香菊花、茎、叶香气中含量大于1%的化合物如樟脑、β-石竹烯、大根香叶烯、桉树脑等，也是野菊精油[13-15]、地被菊花香[16-17]及蒿属植物冷蒿、茼蒿[18-19]的重要成分。

依各器官释放的香气物质来看，花香中香气物质最为多样，且酯类、苯类物质相对丰富，如2-甲基丁酸甲酯、异丁酸乙酯、苯甲醛、乙酸苄酯、乙酸苏合香酯等成分仅在花香中检测到，这可能与花香呈现出浓郁的清香、甜香、果香味道有关。叶香气中α-侧柏酮占有较大比例，叶醇也较多，具有强烈的新鲜草叶的清香及新茶叶和薄荷香。茎中所含脂肪酸衍生物较少，多有木香、薄荷味。神农香菊花朵的香气释放量最高，茎、叶次之。由于植物香气物质的产生与释放受到生长发育的调控[20]，这一结果可能与芳香植物处于花期的授粉作用有重要关系。同时，目前对花香化合物合成相关酶的研究发现，挥发物几乎都在花瓣和其他花器官的表皮细胞中合成，从而能更好地挥发到空气中[21]， 这也与人们的嗅觉感观相符[22]， 因此初步推测花朵是神农香菊的主要释香器官。而其他营养器官只在受到伤害(如机械损伤、病虫侵染)时才释放少量的香气物质[23]，如薄荷在叶片的腺体中积累了大量的花香物质，但叶片的释放量却很低[24]。

总体来说，神农香菊花、茎、叶香气组成相似，萜烯类化合物均是其最主要的挥发物。花、茎、叶中主要挥发性化合物含量的差异可能与不同组织器官的特异性、香气合成底物及香气化合物合成酶基因的时空特异性表达有关。在后期的研究中，本课题组将借助分子手段克隆神农香菊香气化合物合成基因及相关酶基因，分析其功能和表达模式，探索重要花香基因的生物合成途径及调控机制，以为菊花花香育种提供理论基础。

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