两株红树内生真菌共培养正丁醇萃取部位化学成分研究*

李春远，黄 松，佘志刚，林永成，周世宁

(1. 华南农业大学理学院生物材料研究所，广东 广州 510642；2. 中山大学化学与化学工程学院，广东 广州 510275；3. 中山大学生命科学学院，广东 广州 510275)

海洋红树林微生物已成为寻找新药先导化合物的重要资源[1]。内生真菌K38和E33分别采集自我国湛江湿地红树植物秋茄叶片及麒麟菜枝干，两者单独发酵的粗提物基本不显示抗菌活性，但共培养液萃取物对小麦赤霉等多种危害农业和水果的病菌显示出较强抗菌作用[2]。前期我们分别系统研究了两株菌的代谢产物[3-7]，并对两菌共培养液乙酸乙酯提取物进行了分离[8-13]。本文进一步开展了两株菌共培养液正丁醇萃取物的研究，共分离鉴定了10种化合物，分别为环(L-苯丙-L-脯)二肽(1)，环(D-脯-L-苯丙)二肽(2)，环(L-苯丙-反-4-羟基-L-脯)二肽(3)，环(顺-4-羟基-D-脯-L-苯丙)二肽(4)，环(L-脯-L-酪)二肽(5)，环(D-脯-L-酪)二肽(6), 环(D-脯-D-色)二肽(7)，木糖醇(8)，腺苷(9)，尿苷(10)，其中化合物6为首次从真菌中分离到，化合物2，6，7，8为首次从海洋真菌里获得。

1 结果与讨论

化合物1的1H NMRδ7.98 (1H, br s)，4.08 (1H, dd, 4.4, 8.0 Hz), 4.35(1H, t, 4.5 Hz)和13C NMRδ169.0, 165.2表明分子可能是环二肽类化合物，根据1H NMRδ7.19～7.27(5H, m)，3.27(1H, m ), 3.35(1H , m ), 4.35(1H, t, 4.5 Hz)推测分子含有苯丙氨酸残基，由于1H NMR只显示δ7.98 (1H, br s)一个酰胺质子信号，结合δ1.41 (1H, m), 1.72 (2H, m), 2.01(1H, m), 3.05(1H , m ), 3.40 (1H, m), 4.08 (1H, dd, 4.4, 8.0 Hz)等信号判断另一部分为脯氨酸残基，在此基础上查阅文献[14]对照波谱数据及比旋光度数值基本一致，鉴定化合物1为环(L-苯丙-L-脯)二肽。

化合物2的ESIMS显示其分子量与化合物1完全一致，两者的1H NMR和13C NMR谱也类似，仔细对比二者核磁数据，发现与化合物1相比，化合物2的1H NMR中有一个δ4附近的峰发生显著变化，转移到了δ2.87附近，但结合其13C NMR谱和质谱，容易判断二者仍具有相同的平面结构。进一步对比二者比旋光度，发现化合物2的比旋光度为+67°与化合物1显著不同，表明化合物2是化合物1的旋光异构体，在此基础上与文献[14]波谱数据和比旋光度数据对照基本一致，鉴定化合物2为环(D-脯-L-苯丙)二肽。

化合物3的核磁共振谱与化合物1类似，表明具有类似的分子结构，其1H NMR在δ4附近有δ4.19(1H, m)，4.30(1H , q, 6.4 Hz), 4.40(1H , t, 4.4 Hz)三组峰，比化合物1多一个，同时δ5.12(1H, br s)出现一个活泼H信号, 结合13C NMR中δ67.2的峰，推测分子多了一个OH, 对比两者ESIMS, 进一步确定化合物3是化合物1取代了一个羟基的衍生物，在此基础上查阅文献[15]，对照波谱数据及比旋光度数值基本一致，鉴定化合物3为环(L-苯丙-反-4-羟基-L-脯)二肽。

化合物4的核磁共振谱与化合物2类似，仔细对比化合物4和2的1H NMR，13C NMR及ESIMS, 发现化合物4比化合物2多取代了一个羟基，具有与化合物3相同的平面结构，但化合物4与化合物3相比，1H NMR中有一个δ4附近的峰移到了高场δ2.91附近，推测是由于二者空间结构不同引起的，进一步对比二者比旋光度，发现化合物4的比旋光度为+36°与化合物3的-7.0°显著不同，表明化合物4化合物3的旋光异构体，在此基础上与文献[16]波谱数据和比旋光度数据对照基本一致，鉴定化合物4为环(顺-4-羟基-D-脯-L-苯丙)二肽。

化合物5的核磁共振谱尤其是碳谱与化合物1类似，其质谱分子离子峰m/z283.1[M+Na]+, 261.1[M+ H]+1比化合物1多16，同时1H NMR 的δ6.72(2H，d，8.0 Hz)，7.05 (2H，d，8.0 Hz)及13C NMR中δ155.7的信号(与化合物1相应信号相比移动到低场)表明化合物5是化合物1中的苯丙氨酸残基替换为了酪氨酸残基的类似物。在此基础上查阅文献[17]，对照波谱数据及比旋光度基本一致，鉴定化合物5为环(L-脯-L-酪)二肽。

化合物6ESIMS显示其相对分子质量与化合物5一致，其1H NMR和13C NMR谱表明分子平面结构也是由酪氨酸和脯氨酸组成的环二肽。对比二者比旋光度，发现化合物6的比旋光度为-36.8°与化合物5显著不同，表明化合物6化合物5的旋光异构体，进一步与文献[18]波谱数据和比旋光度数据对照基本一致，鉴定化合物6为环(D-脯-L-酪)二肽。

化合物7的1H NMRδ8.20 (1H, br s)和13C NMRδ169.4, 165.6表明分子同样是环二肽类化合物，1H NMRδ5.70(1H, br s), 7.12(1H, d, 2.0 Hz), 7.17(1H, t , 7.4 Hz), 7.28(1H, t, 6.8 Hz), 7.40(1H, d, 8.2 Hz), 7.63(1H, d, 8.2 Hz)表明分子中可能含有吲哚环，由此推测其中之一的氨基酸残基可能是色氨酸，进一步与化合物1,2,3,4,5的核磁共振数据对比，确认另一部分氨基酸残基仍然由脯氨酸构成，在此基础上查阅文献[19]对照波谱数据和比旋光度数值基本一致，鉴定化合物7为环(D-脯-D-色)二肽。

化合物8的1H NMR仅在δ4.57～3.36之间有信号，表明可能是糖类或多羟基类化合物，13C NMR仅有δ63.4, 73.1, 73.2三个信号，推测具有对称结构。进一步经与文献波谱数据比较[20] , 鉴定此化合物为木糖醇(xylitol) 。

化合物9，10与实验室标准品对照核磁共振谱及硅胶薄层Rf值基本一致，分别鉴定为腺苷和尿苷。

2 实验部分

2.1 试剂与实验仪器

葡萄糖(CP) 、蛋白胨、酵母膏(BR) 、乙酸乙酯(AR)、石油醚(AR)、正丁醇(AR)等为市售。结构测定仪器：Bruker AVⅢ400 MHz核磁共振仪，LCQ-DECA-XP (Thermo，USA)质谱仪, Horiba SEPA-300旋光仪。

2.2 菌种及细胞

真菌E33和K38分别为南海红树林麒麟菜和秋茄内分离出的真菌，种属未定，保藏在中山大学化学学院和生命科学学院。

2.3 菌种发酵培养

同时将两株菌等量接种在培养培养基中，菌种发酵培养基的配比及发酵方法同文献[2]，共培养120 L。

2.4 分离

发酵液过滤, 滤液在50 ℃下浓缩到5 L , 乙酸乙酯萃取二次, 然后用正丁醇萃取二次，合并浓缩正丁醇提取液得提取物85 g。提取物经正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度淋洗分段，再经反相硅胶反复柱层析, 反相高效制备液相色谱和重结晶纯化后得到化合物1(6 mg)，2(2 mg)，3(5 mg)，4(2 mg)，5(10 mg)，6(4 mg)，7(3 mg)，8(15 mg)，9(20 mg)，10(15 mg)。

2.5 化合物的物理和波谱数据

化合物5: C14H16N2O3, 黄色粉末，[α]D-57.5°(c0.5，MeOH)。MS (ESI pos)m/z: 283.1[M+Na]+, 261.1[M+ H]+。1H NMR (400 MHz, CD3OD)δ：1.23 (1H, m)，1.81(2H, m)，2.10 (1H, m)，3.08 (2H, dd, 12.0, 4.0 Hz)，3.59 (2H, m)，4.06 (1H, m)，4.38 (1H, dd, 12.0, 4.0 Hz)，6.72(2H, d, 8.0 Hz)，7.05 (2H, d, 8.0 Hz)。13C NMR (100 MHz, CD3OD)δ:169.6, 165.1, 155.7, 130.3, 126.9, 116.2, 59.1, 56.2, 45.5, 36.0, 28.3, 22.5。

化合物6: C14H16N2O3, 黄色粉末，[α]D-36.8°(c1.0，MeOH)。MS (ESI pos)m/z: 283.1[M+Na]+, 261.1[M+H]+。1H NMR(400 MHz, C3D6O)δ：1.70(1H, m), 1.87(1H, m), 2.15(1H, m), 2.93(1H, dd, 7.1, 14.4 Hz), 3.23(1H, dd, 4.4, 14.3 Hz), 3.39(1H, m), 3.55(1H, m), 4.12(1H, m), 4.31(1H, t, 5.6 Hz), 6.53(1H, br s), 6.77(2H, d, 8.4 Hz), 7.16(2H, d, 8.4 Hz), 8.26(1H, br s)。13C NMR(100 MHz, C3D6O)δ：168.9, 165.1, 156.3, 130.7, 127.6, 115.2, 58.7, 56.3, 44.7, 35.4, 28.1, 22.0。

化合物7: C16H17N3O2, 黄色粉末，[α]D-23.5°(c1.0，MeOH)。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ：1.94(1H, m), 2.01(1H, m), 2.05(1H, m), 2.37(1H, m), 3.01(1H, dd, 10.9,15.1Hz), 3.62(1H, m), 3.69(1H, m), 3.79(1H, dd, 4.1,15.2 Hz ), 4.10(1H, t, 7.5 Hz), 4.40(1H, dd, 3.0, 11.1 Hz), 5.70(1H, br s), 7.12(1H, d, 2.0 Hz), 7.17(1H, t, 7.4 Hz), 7.28(1H, t, 6.8 Hz), 7.40(1H, d, 8.2 Hz), 7.63(1H, d, 8.2 Hz), 8.20 (1H, br s)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ：169.4, 165.6, 136.7, 126.7, 123.3, 122.8, 120.0, 118.5, 111.6, 110.0, 59.2, 54.5, 45.4, 28.3, 26.8, 22.6。

化合物8: C5H12O5, 白色固体。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：4.55(2H, d, 4.6 Hz), 4.49(1H, d 5.4 Hz), 4.33(2H, t,5.4 Hz), 3.50(4H, m), 3.33(3H, m)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ：63.4, 72.7, 73.0。

化合物9: C10H13N5O4，白色固体。FAB-MSm/z(%): 268 [M+H]+；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：3.56(1H, dd, 7, 12 Hz), 3.68(1H, dd, 3.5, 12 Hz), 3.98(1H, dd, 3.5, 7.0 Hz), 4.15(1H, dd,J=3.0, 5.0 Hz), 4.60(1H, t, 6.0 Hz), 5.15(1H,s), 5.41(1H, s), 5.42(1H,s), 5.88(1H, d, 6.0 Hz), 7.30(2H, s), 8.14(1H, s), 8.33(1H, s)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ：156.1, 152.3, 149.0, 139.9, 119.4, 87.9, 85.9, 73.4, 70.6, 61.7。

化合物10: C9H12N2O6,白色针状晶体，θmp:170～171℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ11.16(1H, brs), 7.84(1H, d, 8.0 Hz), 5.77(1H, d, 5.0 Hz), 5.61(1H, d, 8.0 Hz), 5.20(1H, d, 5.5 Hz), 4.94(1H, t, 5.5 Hz), 4.03(1H, dd, 5.5, 5.0 Hz), 4.92(1H, d, 5.5 Hz), 3.97(1H, dd, 5.5, 5.0 Hz), 3.84(1H, dd, 3.5, 3.5 Hz), 3.59(2H, m)。

致谢：本文的核磁共振谱，质谱等波谱测试均在美国密西西比大学药学院&美国国家天然产物研究中心完成。

[1] 林永成. 海洋微生物及其代谢产物[M]. 北京：化学工业出版社，2003.

[2] 丁唯嘉，张杰，黎荣棠，等. 两株红树内生真菌混合发酵液提取物抗植物病原菌活性及LC-MS 研究[J]. 广东化工，2010，37(12): 7-9.

[3] 李春远, 杨瑞云, 林永成, 等. 海洋真菌K38号代谢产物的研究[J]. 中山大学学报:自然科学版, 2007, 46(1): 67-70.

[4] LI C Y, YANG R Y, LIN Y C, et al. A new nonadride derivative from mangrove fungus (strain No. k38). Journal of Asian Natural Products Research[J]，2007, 9(3)：285-291.

[5] 李春远，佘志刚，林永成，等，红树林真菌E33代谢产物的分离及衍生物的制备[J]. 中山大学学报:自然科学版，2007，46(6): 52-54.

[6] LI C Y, DING W J, SHE Z G, et al. A new biphenyl derivative from an unidentified marine fungus E33[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2008, 44(2) :128-129.

[7] 李春远，丁唯嘉，陈敏，等，来自红树林内生真菌E33中的一个新的水杨酸衍生物[J]. 中山大学学报:自然科学版, 2008, 47(1):121-122.

[8] LI C Y, DING W J, SHAO C L, et al. A new diimide derivative from the co-culture broth of two mangrove fungi (strain no. E33 and K38)[J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2010,12(9): 809-813.

[9] 李春远，佘志刚，林永成，等.红树林内生真菌K38和E33混合发酵代谢产物研究[J].中山大学学报:自然科学版, 2010,49(6): 136-138,144.

[10] LI C Y, ZHANG J, SHAO C L, et al. A new xanthone derivative from the co-culture broth of two marine fungi (Strain No. E33 and K38) [J]. Chemistry of Natural Compounds, 2011, 47(3): 382-384.

[11] 李春远，张杰，钟嘉升，等. 两株红树内生真菌混合发酵培养液中代谢产物的分离鉴定[J]. 华南农业大学学报，2011，32(1): 117-119,123.

[12] 丁唯嘉， 黎荣棠，李春远，等. 两株红树林真菌共培养液抗植物病菌成分研究[J]. 广东农业科学, 2011, 38(9): 72-74,77.

[13] 李春远，龚兵，黄素萍，等. 红树林内生真菌K38 和E33 共培养代谢产物研究[J].中山大学学报:自然科学版, 2013,52(2): 66-69.

[14] WANG G H, DAI S K, CHEN M J, et al. Two diketopiperazine cyclo(pro-phe) isomers from marine bacteriaBacillussubtilissp. 13-2 [J]. Chemistry of Natural Compounds, 2010, 46(4): 583-585.

[15] ADAMCZEKI M, QUINOA E, CREWS P. Novel sponge-derived amino acids. 5. structures, stereochemistry, and synthesis of several new heterocycles[J]. Journal of the American chemical society, 1989, 112(2): 647-654.

[16] SHIGEMORI H, TENMA M, SHIMAZAKI K, et al. Three new metabolites from the marine yeastAureobasidiumpullulans[J]. Journal of natural products, 1998, 61(5): 696-698.

[17] 唐丽丹，梁远维，廖小建，等. 海绵Phakelliafusca真菌稻黑孢菌PF18的次级代谢产物研究[J]. 中药材, 2011，34(12): 1877-1879.

[18] 石妞妞, 徐俊, 沈月毛. 从假单胞菌1896 中分离到的5个环二肽类化合物[J]. 厦门大学学报：自然科学版，2011, 50(3) : 637-640.

[19] LI X, DOBRETSOV S, XU Y, et al. Antifouling diketopiperazines produced by a deep-sea bacterium,Streptomycesfungicidicus[ J]. Biofouling, 2006, 22(3/4): 201-208.

[20] 梁之桃, 秦民坚，王峥涛. 竹叶柴胡化学成分的研究[J]. 中国药科大学学报，2003, 34(4) : 305-308.