苏姜猪及其杂交后代HSL基因PCR-RFLP分析

任善茂， 陶 勇， 徐椿慧， 庄 勋， 董晓君， 赵旭庭

(1. 江苏农牧科技职业学院， 江苏 泰州 225300； 2. 江苏省淮安市淮安区畜牧兽医站， 江苏 淮安 223200)

猪激素敏感脂肪酶(HSL)基因是影响脂肪代谢的重要候选基因之一，基因全长10～11 kb，有9个外显子，编码171个氨基酸[1]，定位于6q1.2[2]。猪HSL基因在不同组织中的表达存在较大差异性，在心肌和骨骼肌中HSL基因mRNA含量极少[3]。Otsu等认为HSL基因所在的染色体区域可以作为影响猪瘦肉率、肌内脂肪等屠宰性状的重要区段[4]，曲亮等将HSL基因作为影响猪胴体重要性状的候选基因进行相关研究[5]。因此，本试验利用PCR-RFLP方法研究了苏姜猪及其杂交后代群体内HSL基因外显子I的多态性，为进一步分析HSL基因与猪背膘厚、瘦肉率等胴体性能的关系奠定分子生物学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选用江苏姜曲海种猪提供的苏姜猪、长苏猪(长白猪×苏姜猪)、大苏猪(大白猪×苏姜猪)各60头，90 kg左右。每头猪采集10 mL血液，ACD抗凝。采用常规的酚/氯仿/异戊醇法抽提血液DNA，乙醇沉淀，溶于TE缓冲液。使用BD-100超微量核酸蛋白分析仪测定浓度后，稀释至50 ng/μL分装，-20℃保存备用。

1.2 主要设备与试剂

ABI梯度PCR扩增仪(美国)，DYY-6C恒压恒流电泳仪(北京六一)，垂直板电泳槽装置(北京东方)，Eppendorf冷冻离心机(USA)，GDS-8000型凝胶成像系统(美国UVP公司)。

TaqDNA聚合酶、dNTP购自上海华美生物工程公司，DNA Marker、BsaH I购自上海生工生物工程技术服务有限公司，丙烯酰胺(Acrylamide，Acr)、N-N′亚甲基双丙烯酰胺(Bisacrylamide，Bis)购自南京基天生物技术有限责任公司。

1.3 引物设计与合成

根据猪HSL基因序列(Genbank登录号：AJ000483)，参照文献[6]设计一对引物，序列为：上游引物(PF)5′-CGCACAA TGACACA BT CA CT GGT-3′，下游引物(PR)5′-AGGCAGCGGCCGT AGAAGCA-3′。扩增片段长度为497bp，位于HSL基因外显子I区域。引物由上海生工生物工程有限公司合成，去离子水溶解，-20℃保存。

1.4 PCR-RFLP分析

PCR 反应体系20 μL：10 × buffer 2 μL，dNTPs 1.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.1 μL( 2U/μL)，上下游引物各0.5 μL，基因组DNA 1 μL，ddH2O补足至20 μL。

PCR 反应条件： 94℃预变性10 min； 94℃变性30 s， 59.5℃退火30 s， 72℃ 延伸30 s， 32个循环； 72℃延伸5 min； 4℃保存。扩增产物以2% 琼脂糖凝胶电泳检测。

酶切体系15 μL：10 × buffer 2 μL，BsaH I内切酶3U，PCR 产物10 μL，ddH2O补足至15 μL， 37 ℃酶切3 h。酶切产物经8% 聚丙烯酰胺电泳检测，电压6 V/cm，电泳8 h，银染显带、照相、记录并保存。

2 结果与分析

2.1 PCR-RFLP结果

PCR扩增结果见图1，没有发现非特异性条带，PCR扩增产物大小约500 bp，产物长度与预测结果一致，可以用于进行RFLP分析。

PCR-RFLP结果见图2所示，PCR扩增产物经BsaH I限制性内切酶消化后，表现出了多态性。根据条带数和位置，判定有3种基因型，分别为AA(190 bp、307 bp)、AB(67 bp、190 bp、240 bp和307 bp)和BB(67 bp、190 bp和240 bp)基因型。其中，因片断67 bp较小，电泳时间较长而发生弥散消失。

M：DL2000 DNA marker；1-3：PCR products

M：pBR322/MspⅠ marker；1，5：AB型；2：AA型；3，4：BB型

2.2 HSL基因外显子I基因型和等位基因频率

苏姜猪及其杂交后代不同基因型检出数和等位基因频度见表1。由表1可见，3种基因型在苏姜猪及其杂交后代中均检测出，苏姜猪有更多的等位基因A。

表1 猪HSL基因的基因型及等位基因频率

注：括号内为样本数。

3 讨论

猪HSL基因为调控猪体内激素敏感脂肪酶的基因，外显子I区域内存在G→A的碱基转换，改变了BsaH I酶识别位点，最终导致编码氨基酸Val替换Ile，其不同等位基因在中外猪种群体中的分布差异很大[6]。强巴央宗等[7]在藏猪群体中检测到HSL基因外显子ⅠG→A突变位点，出现3种基因型，表现出多态性，等位基因A和G频率分别为62.50%和37.50%，突变位点的基因分布均处于瘦肉型外种猪和脂肪性地方猪之间。陈利荣等[8]研究发现瘦肉型大白猪、长白猪全部表现为GG基因型，山西黑猪表现为AA、AG和GG 3种基因型，华北杂种野猪、东北纯种野猪及杂种野猪表现为AG和GG 2种基因型，研究结果丰富了国内外对野猪的分子生物学研究，为野猪遗传资源的合理开发利用提供了依据。

本试验中，在苏姜猪及其与长白猪、大白猪的杂交后代群体中均检测到了HSL基因外显子I区域内G→A碱基突变产生的3种基因型，基因型频率分布介于瘦肉型外种猪和脂肪型地方猪种之间，这与HSL的功能特性及苏姜猪的品种来源有一定的关系。HSL主要是将白脂肪中的甘油三酯分解成游离脂肪酸和甘油[9]，因此可以推测，HSL基因外显子I的A→G转换而导致的Ile→Val的替换可能影响HSL的活性，最终影响到猪的背膘厚、瘦肉率或肌内脂肪含量。苏姜猪是以地方猪种姜曲海猪、枫泾猪与国外猪种杜洛克猪为亲本、历经10余年培育而成的瘦肉型新品种猪，2013年通过了国家畜禽种质资源委员会品种审定，获得了新品种证书[10]。因此，今后将开展HSL基因外显子I区域内的G→A碱基突变多态与苏姜猪背膘厚、瘦肉率等胴体性状的相关性研究。

参考文献:

[1]Harbitz I, Langset M, Ege A G, et al. The porcine hormone-sensitive lipase gene: sequence, structure, polymorphism and linkage mapping[J]. Animal Genetics, 1999, 30:10-15.

[2]Mellink C H M, Lahbib-Mansais Y, Yerle M, et al. Localization of four new markers to pig chromosomes 1, 6 and 14 by radioactive in situ hybridization[J]. Cytogenet Cell Gnet, 1993, 64:256-260.

[3]Egan J J, Greenberg A S, Min-Kun C, et al. Mechanism of hormone-stimulated lipolysis in adipocytes: translocation of hormone-sensitive lipase to lipid storage droplet[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89:8534-854.

[4]Otsu K, Khanlla V K, Arhibald A L, et al. Cosegregation of porcine malignant hypertheha and a probable causal mutation in the skeletal musele ryanone receptor gene in back cross tamilies[J]. Genomies, 1991, 11:744-750.

[5]曲 亮，黄瑞华，李开桢，等. H-FABP和HSL基因多态性对苏淮猪胴体性状的影响[J]. 南京农业大学学报, 2008, 31 (3): 107-112.

[6]Knoll A, Stratil A, Nebola M, et al. characterization of a polymorphism in exon I of the porcine hormone-sensitive lipase (LIPE) gene[J]. Animal Genetics, 1998, 29:460-477.

[7]强巴央宗，商 鹏，杨 涛，等. 藏猪激素敏感脂肪酶(HSL)基因遗传多样性分析[J].西南农业学报,2012,25(5):1904-1906.

[8]陈利荣，贾艳梅，韩俊文.BsaH I对猪激素敏感脂肪酶基因外显子I的PCR-RFLP分析[J].生物学杂志,2009,26(3):19-21.

[9]苗志国，李国旺，谢红兵. 金华猪与长白猪脂肪组织中HSL mRNA丰度的差异研究[J]. 广东农业科学,2011(4):128-130.

[10]唐现文，韩大勇，周春宝，等. 苏姜猪四至六世代雌激素受体(ESR)基因PvuⅡ多态性分析[J]. 浙江农业学报,2013,25(5):965-970.