植物抗病性及诱导抗性在匍匐翦股颖病害防治中的应用

马晖玲，房媛媛

（甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070）

匍匐翦股颖（Agrostisstolonifera）为禾本科多年生草本植物，是一种应用广泛的冷季型草坪草，匍匐茎横向蔓延能力强，能迅速覆盖地面，形成密度很大的草坪。其适应性强、用途广、品质好、耐频繁低度修剪，是用做高尔夫球场果、草地网球场、草地保龄球场等精细草坪的首选草种，也用于庭院、公园等养护水平较高的绿地。匍匐翦股颖不定根入土较浅，喜水，但易感病，如币斑病、褐斑病、霜霉病、雪腐病、黑粉病等是其常见的严重病害［1］。

随着分子生物学的发展以及对植物和病原物相互作用的深入了解，利用诱导剂诱发植物本原抗病性的思想和理论得以提出和应用，这是目前草坪病害防治的一条有效而环保的途径，可为未来创建无污染无毒害的纯天然绿色草坪开辟新道路。

1 草坪病害抗性诱导防治的优点

长期以来草坪病害的防治方法多采用培育、利用抗病品种及使用化学杀菌剂［2－3］。传统抗病育种方法育种周期长，病原小种的分化速度往往超过品种更新换代的速度，难于对新的病原小种作出及时反应，其应用受到了很大的限制。化学杀菌剂对病害的防除效果大多不理想，而且化学农药的喷施和在土壤中累积会严重污染环境。随着社会经济的不断发展，化学杀菌剂的使用剂量不断提高，已对环境造成巨大污染，直接影响人类的健康。长期施用化学杀菌剂会改变草坪生态系统中原有微生物之间的动态平衡，破坏固有的拮抗作用，可能导致非靶性病害增长［4］。据南志标［5］报道，用苯莱特拌种防治牧草病害，却导致腐霉引致的猝倒病发病率上升。国外使用土壤熏蒸处理等方法防治杂草、线虫和病原真菌（引起苗腐），常导致草坪草全蚀病加重［6］。并且，长期、大量使用杀菌剂会使病原菌产生抗药性，导致病菌变异，产生新的小种或变异系，使病害防治工作更加困难。

因此，有必要寻求用于植物病害防治的一种可持续发展的方法或途径。分子生物学的发展大力助推了草坪病害防治技术和手段，由此而产生了生物防治技术等［7］，其中利用诱导剂诱发植物本原抗病性已成为植物病害防治的新型技术，这一理论和技术具有抗性稳定、持久、不污染环境等优点，为农业和经济的可持续发展提供了有利条件。利用新型诱导剂诱导草坪植物本身固有的抗病性，进行草坪病害的治理是目前草坪病害防治的一条有效而环保的途径，也是草坪病害防治研究的热点。抗病性诱导剂用量少，无环境污染，防治效果好，是一种具有广泛应用前景的新型植物病害防治剂，将大幅减少和替代化学杀菌剂的使用，保护环境，节约草坪维护费用。

2 植物的抗病性诱导和生理响应

植物的抗病性归根结底是有关抗病基因通过酶蛋白的表达、有关抗病调控物质的产生来实现的，它是建立在一系列的物质代谢的基础上的，是植株体在形态结构和生理生化等方面形成一种综合的性能以抵抗病害入侵所表现出的结果。大量的研究表明，植物抗病方式和途径是复杂的、多方面的，它包括组织细胞、分子结构和生理功能的一系列复杂变化。

2．1 植物抗病性的形成与信号传导

植物产生抗病性与信号分子之间的传导有着极其重要的关系，目前该研究领域的重点和热点是，就植物不同的抗病性诱导方式探索出各自的抗病信号传导物种类和传导路线。

2．1．1 活性氧和一氧化氮的作用 初步的研究结果表明，植物抗病的早期反应之一是活性氧（ROS）的产生。活性氧不仅对病原有着抑制作用或杀伤力，它更是重要的触发信号，一方面诱导被侵染部位的过敏反应，另一方面还可以启动邻近细胞产生自我保护反应［8－9］。并诱导防卫基因的表达。

Delledonne等［10］证实NO也作为信号分子与ROS协同作用，激活HR（过敏反应）并诱导植物抗病基因的表达，而且二者通过水杨酸（SA）信号途径激活并增强植物防卫反应。

2．1．2 信号传导途径及其信号传导物质 现已明确，植物体内的两条抗病信号传导途径分别是：水杨酸（SA）信号传导途径和茉莉酸（JA）／乙烯（ET）信号传导途径。SA信号途径，即由局部过敏反应扩展到植物系统获得抗性（SAR），信号传导物质一般为SA等类似物。JA／ET信号途径，意指依赖于JA／ET信号传导的诱导系统抗性（ISR）。两条信号途径往往相互配合，在植物防卫信号传导过程中交叉作用［11］。

2．2 植物抗病基因及其表达

植物的抗病性及其强弱程度是由植株体内抗病基因的存在和这些基因的表达水平以及基因表达所产生的抗病物质的量所决定的。病菌感染植物后，常会诱导一些抗病相关基因的表达，相继启动一些抗病反应，产生抗病物质，以此抵御病原物的侵染。病程相关蛋白PRs基因直接与SAR防御反应相关联［12］，科学研究人员已分离和克隆出一些相关的植物抗病基因，如几丁质酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因等抗病基因，几丁质酶和葡聚糖酶都属于PRs，为细胞壁水解酶类，在体外表现出抗病菌活性［13］。几丁质酶基因已在水稻（Oryzasativa）、烟草（Nicotianatabacum）等植物中表达，可抑制一些致病真菌细胞如立枯病病原的生长［14－15］，也能抑制霜霉病和黑胫病菌的增殖［16］。

现今的科学研究结果逐渐表明，在不同的抗病性诱导方式下所表达的基因类型是不同的，其中有共性的，也有特异的基因种类及其调控因子。

2．3 物理屏障

植物细胞壁在抗病反应中起着一定的作用。要阻止和延迟病原物在植物体内的生长，首先需要形成一个物理障碍，这个物理屏障的形成主要包括植物细胞的木质化过程，即在细胞壁中沉积木质素、产生乳突及胼胝体、侵填体、胶滞体等，这些结构上的变化均可以不同程度地阻止病原物的侵入和蔓延［17］。有利于赢得更多的时间来启动其他的抗性反应，多途径地增加植物对病害的抵抗力。研究已表明，化学物质可以引导细胞壁产生抗性，如番茄被脱乙酰几丁质处理后，其细胞壁显著加厚，胞间被填塞（侵填体），当镰刀菌入侵时，形成大量乳突，病菌菌丝被包埋，从而阻止了病菌的扩展［18］。在植物受病原侵染的情况下，细胞壁的两类结构蛋白（富含羟脯氨酸和甘氨酸的糖蛋白）合成增加，以巩固细胞壁结构，增强其进一步抵抗病原物侵染的能力［19］。在杨树抗溃疡病研究中，胡景江等［20］发现杨树（Populus）经诱导后其羟脯氨酸糖蛋白（HRGP）和木质素含量显著提高。

2．4 抗病生理生化响应

植物受到某些外界因素刺激或诱导后，可引起植株形态结构和生理状态发生变化，产生抗病物质，使植株体具有抗病性。这些抗病物质主要包括：过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化氢酶（CAT）、几丁质酶（CHI）、超氧化物歧化酶（SOD）、酚类、植保素、HRGP、木质素、硫堇、植物凝集素等［21－22］。

植物感受病原刺激信号后，会启动一系列抗病防御反应。苯丙烷类代谢途径是植物次生代谢产物形成的重要途径，其分支途径为木质素合成途径和黄酮类物质合成途径，可产生酚类物质、木质素和植保素等苯丙烷类代谢产物，这些都是重要的抗菌物质，在植物的抗病过程中起着重要的作用。苯丙烷类代谢途径中重要的酶包括PAL、C4H、4CL、CHS等，其中PAL为关键酶和限速酶［23］。PPO将酚类物质氧化成高毒性的醌类物质，对病原物起到毒杀和限制的作用［24］。植物保卫素（类黄酮、类萜类、单酚和异类黄酮等类）是一些低分子量的抗菌化合物，一般出现在病原侵染部位附近，增强植物的抗病能力［25］。多酚类物质（羟基二酚、绿原酸、花色素苷等）可作为病原物的拮抗剂，抑制孢子的萌发和菌丝生长，有时还可抑制或钝化病原菌产生的毒素和酶活性［26］。

高等植物体内普遍存在着CHI和GLU（β－1，3－葡聚糖酶）等病程相关蛋白，是植物抵抗病原微生物侵染的重要物质，病程相关蛋白与植物的系统获得性抗性反应直接相关［27］。

在植物细胞防御酶系中，SOD的主要作用是歧化超氧阴离子（·O2－），产生过氧化氢（H2O2）和O2，减少过量活性氧（ROS）对植物体细胞的伤害。POD和CAT协同作用，将把对细胞有伤害的H2O2转化为H2O。

3 植物抗病性诱导及其机理的探索

通过各种方式激发植物对病原微生物的本原的抵抗力，即诱导植物抗病性。据分析，植物抗病性的产生可能是病原物或外源诱导因子激发了植物体内信号分子，一系列信号分子进行信号的传导，进而启动了相关抗病基因的表达，基因表达产物通过多种形式，如防御屏障的形态建成、抗病蛋白及次生代谢物质的产生、抗病生理生化响应的开启或强化等，积极、主动地参与到植物抵御病原物入侵的过程中。摸清和阐释诱导因子和信号分子的种类及作用方式、抗病基因的类型及表达调控因子是诱导抗病性的根本和核心。

植物在感病或外源因素刺激的情况下会产生复杂的生化反应和生理响应，根据抗病性诱导的相关理论，植物感受刺激信号后通过信号转导过程来调控细胞内抗病相关蛋白的表达量，进而调整自身形态或生理状态来抵御病原的侵染。共性诱抗途径的框架已基本明晰，即诱导剂（或病原物）的刺激－信号分子的激活和传导－相关抗病基因的表达调控－相关防御蛋白和次生代谢物的产生及酶活性激发－病原菌侵染抵抗力的获得。倘若确定上述诱抗途径中各环节的证据数值及其特征，可系统地揭示植物抗病性诱导的作用机理。科学研究发展至今，引起诱抗反应的系统性机制尚未完全阐明，有关植物抗病性诱导的机理，目前普遍认同两种方式，即系统获得抗性（SAR）和诱导系统抗性（ISR）。有害病原物初次侵染后可在植物体内激发出一种系统性抗性，植物体未受侵染部位也对致病菌（病毒、真菌、细菌）产生广谱抗性，这种抗病性需要通过SA信号传导途径而获得，即称系统获得抗性（SAR）；诱导系统抗性（ISR）则是由分布在植物体根部的非致病性根际促生菌所激活，依赖JA／ET信号传导途径而使植株体获得抗病性［28］。

3．1 SAR机制

3．1．1 诱抗信号分子及其传导途径 Goarlach等［29］和 Lawton等［30］于1996年分别在小麦（Triticumaestivum）和拟南芥（Arabidopsisthaliana）的研究中报道了苯并噻二唑（BTH）可引起系统获得抗性。有研究表明，SAR反应的起始阶段伴随SA水平的上升，一些具有抗菌能力的病程相关蛋白得到表达［31］。有研究报道，转NahG基因的植物体不能积累SA，以病原菌诱导处理其转基因隐形突变体sid1、sia2、pad4后，植物体不能产生SA，也不能激活病程相关蛋白基因的表达［32］。这说明在SAR信号途径中，SA是一个必需的信号分子。

目前，已经明确一些病原菌［33］和化学药剂如SA、BTH、草酸［34］、壳聚糖［35］等可激发病程相关蛋白的产生，诱导植物产生抗病性。拟南芥突变体dir1的SAR信号传导涉及一种脂质转移蛋白，表明传导信号也可能包括一个脂质组分［36］。

依SAR机制，激活物可在植株体局部诱导抗病反应，继而这种反应如信号一般传遍植株体各个部位，使得整个植株系统地获得抗病性，这种反应信号的传导是一种短距离的传递。近年来国内外学者对植物系统获得抗病性（SAR）进行了大量研究。结果表明，在植物的诱导部位产生的信号通过韧皮部传导，一方面诱发SAR基因表达，基因表达产物本身直接或间接地杀死入侵病原物，从而抑制病原物的侵染；另一方面，植物组织内的水杨酸遇到诱抗信号后，迅速活化成为一种伴随病原物而存在的精细调控机制，放大和加强非特异性病原信号，活化非特异性防卫反应机制，从而使植物系统获得抗病性［25，37－38］。

3．1．2 SAR方式引发的生理生化反应 SAR反应会诱发产生苯丙氨酸代谢的起始酶——苯丙氨酸解氨酶，其催化启动苯丙氨酸代谢反应，苯丙氨酸代谢反应可产生多种抗菌物质，如黄酮类物质，缩合单宁，香豆素，木质素和水杨酸等［39］。植保素是SAR反应后出现的次生代谢物，对病原菌具有抗性［40］。

SAR反应还可引起植物细胞壁组成成分增加，胞壁交接处组织结构增厚，木质、胼胝质增加，以抵御病原菌的入侵［41］。

在SAR方式下引发的生理反应中，病程相关蛋白的产生是一个主要的抗病表现形式。研究发现，病原菌侵染后的植株体中会大量积累PR蛋白，而在未侵染过的健康植株体中则缺少PR蛋白［42］。部分PR蛋白与葡聚糖酶、几丁质酶活性的激活有关，这两种酶可分别降解病原菌细胞壁的主要成分［43］。

3．1．3 SAR方式下病程相关基因的表达调控 病程相关蛋白PRs基因是主要的SAR抗病基因。现已确定NPR1（或NIM1）是一种重要的SAR基因调控蛋白，以激活PR基因的表达［44］。TGA1和TGA2是PR－1基因的启动子，NPR1可促进PR基因启动子TGA2与其调节元件——SA应答元件的结合，正调控PR－1基因的表达［45－46］。

有研究还表明，在SAR反应中，植物细胞中积累氧化剂，引起氧化还原反应，将NPR1由不活跃的低聚复合体还原为活跃的单体形式。当NPR1的还原反应被抑制时，PR－1基因的表达受阻，这表明SA信号通过细胞氧化还原反应与NPR1的调控作用相关联［28］。研究还发现NPR1在调控PR基因表达的同时，还调控一些分泌蛋白基因的表达，若突变体中分泌蛋白量减少，其抗病水平则会降低［47］。

3．2 ISR机制

3．2．1 信号分子、传导途径和作用特点 科学研究最初发现，植物根部产生的伤流液、溶菌产物可吸引大量根际促生菌［48］的繁殖，这些非致病性根际促生菌可促进植物生长，还可以抑制某种病害的侵染［49］。一些根际促生菌相互之间具有拮抗性，可直接抵御某种病害的侵染，另一些则通过诱发启动植物体内的抗病反应，来降低植株地上部分的发病率，这种抗病反应称为诱导系统抗性（ISR）。在豆类，康乃馨（Dianthuscaryophyllus）、黄瓜（Cucumissativus）、萝卜（Raphanussativus）、烟草、番茄（Lycopersiconesculentum）及拟南芥等植物中发现存在着ISR反应，其有着广谱抗性［50］。ISR反应往往由土壤根际的植物促生菌（PGPR）所激活，Nandakumar等［51］报道，水稻对Rhizoctoniasolani的抗性可被P．fluorescens株系PF1和FP7所激发。Suzuki等［52］同样在匍匐翦股颖中发现P．fluorescens株系HP72可以引发匍匐翦股颖对R．solani的抗性。

对于ISR方式，最初的研究普遍认为，ISR反应往往会导致病程相关蛋白的积累［28］。Hoffland等［53］用ISR的诱导物－荧光假单胞菌杆菌WCS417r处理萝卜，拟增强植株体对镰刀菌枯萎病的抗性，但结果植物体中并没有积累病程相关蛋白。Pieterse等［54］在拟南芥的研究中发现，荧光假单胞菌杆菌WCS417r可诱导拟南芥NahG植株产生对Fusariumoxysporumf．sp．raphani和PstDC3000的抗病性，但不能同步激活SAR的标志基因PR－1、PR－2和PR－5。相关的研究还表明，拟南芥突变体eds8和WCS417r的JA信号传导过程受损，植株易感染P．syringae［55］。上述研究认为，WCS417r可诱导植株体产生ISR反应，这种抗性反应的信号传导途径与SAR的信号调节机制是不同的，这种非水杨酸途径即称为JA／ET信号途径。但非所有ISR防御反应都依赖JA／ET信号途径［28］。研究还表明，在植株缺铁状况下一些荧光假单胞菌杆菌株系可以作为铁载体［56］行使功能。

科学研究现已表明，在ISR方式中信号分子一般是乙烯（ET）和茉莉酸（JA）等。Cortes－Barco等［57］在烟草的研究中发现丁二醇（BDO）和PC1（加拿大石油公司产品）对烟草炭疽病有显著的抑制作用，认为BDO诱导的抗病性是通过ISR方式产生的。

据研究报道，拟南芥突变体eir1的根部对ET不敏感，而地上部对ET敏感，根部施入WCS417r则不能产生ISR反应，而必需再从叶面施入ET后才可产生ISR反应，这表明一些根际促生菌诱导抗病性时需要ET的介导［58］。另有研究分别将WCS417r根部施入拟南芥JA响应型突变体jar1和ET响应型突变体etr1后，均不能增强植株对PstDC3000的抗性，这表明ISR反应中需要JA与ET同时参与［59］。

在诱导拟南芥对PstDC3000产生系统抗性的研究中还发现不同信号途径可交叉作用，依赖SA信号的SAR途径与依赖JA／ET信号的ISR途径的抗病性具有累加效应［60］。

3．2．2 ISR方式下的抗病基因及其表达调控因子 研究表明，参与ISR反应的抗病基因与SAR基因是不同的［28］。在对拟南芥ISR方式的研究中发现，JA／ET响应型基因 LOX1、LOX2、VSP2、PDF1．2、HET、PAL1、CHI－B、PR1、PR4可被JA／ET信号激活，并得以表达，表达产物对多种病原菌产生抗性［61－62］。也有研究表明，病原菌和JA可激发AtMYC2基因的表达，且AtMYC2作为负调控子，在JA／ET应答型基因表达中发挥着重要作用［62］。Cortes－Barco等［57］的研究表明，BDO可激发抗病基因（合成茉莉酮酸酯相关的基因）如 AsAOS1、AsOPR4和AsGns5基因的表达。目前发现的与ISR方式有关的抗病基因还有：在番茄中编码植物脱毒的氢氰酸分解酶基因LeCAS［64］、烟草中编码3－羟基－3－甲基－戊二酰基辅酶A还原酶基因HMGR和脂氧合酶基因等［65］，这些基因的表达往往与ET和（或）JA所传导的信号过程相关联。

也有研究报道JA和ET在拟南芥中可共同调节一系列编码PR蛋白的基因，包括PR－3，PR－4和PR－1等［66］。

SAR的调控蛋白NPR1同样也参与ISR反应过程。研究发现WCS417r单独存在时不能诱发拟南芥npr1突变体产生ISR反应［59，67］，与SAR方式相同，WCS417r诱发ISR时也需要NPR1调控抗病基因的表达。在JA和ET传导的ISR反应中，NPR1在功能基因的下游调节元件上产生调控作用［59］。NPR1在SAR与ISR方式中均可行使调控功能，但不会发生互斥，SAR与ISR相关基因可同时被NPR1激活，以增强植株的抗病性［67］。如在康乃馨根部施入WCS417后，可增强其对Fusariumoxysporumf．sp．的抗性，诱导处理的康乃馨植株经病原接种后，其植保素水平较对照植株快速上升［68］。

研究还表明，拟南芥功能基因ISR1位点编码一个新元件，可能是ISR信号分子ET的应答原件，ET对ISR1位点的特异识别在其诱导抗病性中具有重要意义［69］。而ET对该隐形等位基因的iSR1相应位点不敏感，这种情形下的拟南芥植株易受PstDC3000感染［70］。

Devoto等［71］研究结果表明，JA信号可诱导包括野生型和突变体在内的212个植株的抗病相关基因的表达，其中约84%的基因表达需要COI1（a F－box protein）的参与，这表明COI1是JA信号传导途径中抗病基因的调控因子。

4 植物抗病性诱导理论在匍匐翦股颖病害防治中的应用及前景展望

4．1 SAR方式的应用

有关BTH诱导草坪草抗病性的研究，仅2003年Lee等［72］报道了BTH可诱导匍匐翦股颖Crenshaw，Penncross和Providence品种对核盘菌（Sclerotiniahomoeocarpa）引起的币斑病产生抗病性，但对其他品种如L－93，BTH 是无效的。

4．2 ISR方式的应用

2003年Suzuki等［52］在匍匐翦股颖的抗病性诱导研究中发现P．fluorescens株系HP72可引发匍匐翦股颖对立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）的抗性。2004年Ryu等［73］研究认为，植物根际促生菌分泌的挥发性有机物2，3－butanediol及其同分异构体在诱导植物产生抗病性的过程中具有重要的作用。之后的几年中，有关单子叶植物基于ISR方式的抗病性诱导及其相关抗病基因表达的研究报道寥寥无几，直至2010年，加拿大学者Cortes－Barco等［74］报道了把BDO（2R，3R－butanediol）和PC1（异链烷烃混合物）以ISR方式根部施入植株体后可抑制分别由真菌Sclerotiniahomoeocarpa，R．solani和Microdochiumnivale导致的3种草坪叶病。施入PC1或BDO可减少匍匐翦股颖叶病区域至20%～40%。2011年，Hsiang等［75］选用诱抗剂Civitas（加拿大石油公司产品）诱导匍匐翦股颖对币斑病的抗性，施用后病害面积减少20%～40%，并经ISR基因表达对比，确定Civitas是经ISR途径诱导匍匐翦股颖抗病性的。同年，马祥等［76］报道了BDO可诱导匍匐翦股颖产生抗病性，其抗病效果优于通过SAR途径由BTH引致的抗病性。2013年，Hsiang等［77］再次用诱导剂Harmonizer（加拿大石油公司产品）和Civitas诱导匍匐翦股颖对币斑病的抗性，抗病率分别达到45%和58%。尤为关注的是，这两种诱导剂混合物的施用使得匍匐翦股颖对币斑病的抗病率高达69%。与此同时，基因表达分析表明，经Harmonizer诱导后匍匐翦股颖中PR－1、PR－5和PR－10等20个病程相关基因超量表达，但其诱导抗病性的作用途径与ISR或SAR均不完全吻合。

截至目前，以诱导剂激发匍匐翦股颖体内抗病性的研究已有初步的成果，更深入的相关研究继续进行着。利用诱导剂诱发植物固有的抗病性，这一理论和技术具有抗性稳定、持久、不污染环境等优点，新型诱导剂在匍匐翦股颖病害防治中的应用将为开展节能、环保和低碳的草坪管理理念和市场运作模式提供技术支撑。但诱导植物抗病性是复杂的反应过程，需更加深入、系统地阐明匍匐翦股颖本原抗病性诱导过程中信号分子类型、传导途径、相关抗病基因的表达及其调控因子，也需要研究和完善诱导剂的生物活性筛选体系、田间药效试验技术［19，26］等，才可以使得新型、环保的抗病策略和诱导剂在实践应用中得以畅通实施。

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