Ta6－SFT基因对油菜的转化及抗旱性分析

李淑洁，张正英

（1.甘肃省农业科学院生物技术研究所，甘肃 兰州730070；2.甘肃省农业科学院科研管理处，甘肃 兰州730070）

油菜（Brassicanapus）是我国最重要的油料作物，它不仅是食用油的主要来源，也是解决全球能源短缺的重要原料作物。油菜是需水作物，尤其是在抽薹以后，对水分需求更加旺盛和敏感。而油菜种植区频繁发生的季节性干旱对油菜产量造成巨大的影响。通过研究植物抗旱机制，利用基因工程技术选育抗旱的油菜新种质，是现在和以后油菜生物技术育种的重要组成部分。

果聚糖是一种以蔗糖为底物由果聚糖转移酶基因催化合成的果糖基聚合物，它不仅是一种重要的贮藏性碳水化合物，也是一种渗透调节物质，其分解产生的单糖能够提高液泡溶质浓度，增强植物对多种不良环境胁迫的抗性。在细菌中，只有果聚糖蔗糖酶参与果聚糖的合成；在植物中，果聚糖的合成以蔗糖为底物进行合成，主要的酶有1－SST（蔗糖：蔗糖1－果糖基转移酶）、1－FFT（果聚糖：果聚糖1－果糖基转移酶）、6－SFT（蔗糖：果聚糖－6－果糖基转移酶），产物主要储存于细胞液泡中。

研究证实，果聚糖代谢是植物抵抗逆境胁迫的途径之一，它的积累可以使植物在干旱、低温等多种胁迫下的抗逆性增强。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）来源的果聚糖蔗糖酶基因（sacB）是较早克隆的基因。Van der Meerl等［1］将sacB导入非果聚糖积累型的马铃薯（Solanumtuberosum）中，转基因植株的叶片和小块茎内均有相当量的果聚糖积累，改变了马铃薯植株原有的碳分配模式。Ebstkamp等［2］将sacB导入烟草（Nicotiana tabacum）植株，发现转基因烟草中果聚糖的积累能明显提高植株的抗旱性。植物来源的果糖基转移酶基因相继从大麦（Hordeumvulgare）［3］、小 麦 （Triticumaestivum）［4－5］、菜 蓟 （Cynarascolymus）［6－7］、菊 芋 （Helianthustuberosus）［8－9］等物种中分离出来，并在烟草、马铃薯、牵牛花（Pharhirisnilqianniuhua）、菊苣（Cichoriumintybus）和甜菜（Betavulgaris）中进行了转化。Hellwege等［7］将来自菜蓟的1－SST和1－FFT转入马铃薯，在收获的转基因马铃薯块茎中检测到了聚合度较高的菊糖型果聚糖，果聚糖代谢途径的引入，不仅转基因马铃薯的抗旱性明显提高，而且植物体内的脯氨酸含量也显著增加。李慧娟等［10］从莴苣（Lactucasativa）中克隆1－SST并导入烟草，抗旱性试验表明1－SST提高了烟草转基因植株的抗旱性，同时转1－SST烟草抗冻性也明显提高。张小芸等［11］将从冰草（Agropyroncristatum）中克隆的Ac1－FFT导入黑麦草（Loliumperenne），转基因黑麦草株系中的可溶性总糖含量和果聚糖含量明显高于对照植株，耐旱性提高。

果聚糖合成酶基因导入油菜的研究还未见报道。本研究将从抗旱小麦品种扬麦6号中克隆的蔗糖：果聚糖－6－果糖基转移酶基因（Ta6－SFT）导入综合性状优良的甘蓝型油菜自交系材料，通过rd29A启动子的调控使Ta6－SFT在转基因油菜中逆境诱导型表达，研究Ta6－SFT在转基因植株正常条件和干旱胁迫下的表达特性，以及由此引起的转基因植株体内果聚糖含量和相关生理指标变化，分析Ta6－SFT对转基因油菜抗旱的作用，探讨通过分子手段培育抗旱性油菜新品种的可行性，为改良油菜品质，提高油菜抗旱性和扩大其栽培范围奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘蓝型油菜自交系材料1号、2号、5号为甘肃省农业科学院作物科学研究所油菜育种组提供。Ta6－SFT、rd29A启动子分别由中国农业科学院作物科学研究所叶兴国博士和甘肃农业大学生命科学院司怀军博士惠赠。植物表达载体 pCAMBIA－rd29A－6－SFT由课题组构建（图1），大肠杆菌（Escherichiacoli）菌株DH5a、根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株LBA4404为甘肃省农业科学院生物技术研究所实验室保存。

图1 pCAMBIA－rd29A－6－SFT植物表达载体结构简图Fig.1 Sketch of plasmid pCAMBIA－rd29A－6－SFT

1.2 Ta6－SFT 对油菜的转化

农杆菌的活化、子叶预培养、农杆菌浸染、共培养等实验方法参照李淑洁等［12］的方法。

将经过共培养的外植体首先用10mg/L草胺膦（以下简称ppt）选择培养2～3周后，将分化出的抗性不定芽和抗性愈伤组织转入附加有ppt 15mg/L的分化培养基上继续筛选。待不定芽长到1cm以上时，切下并接入生根培养基上进行生根培养，2周左右长出不定根。

1.3 转基因工程植株分子检测

提取抗性植株基因组DNA，以含Ta6－SFT质粒DNA为阳性对照，未转化植株为阴性对照，用Ta6－SFT特异引物进行PCR扩增以检测抗性植株中目的基因是否整合。PCR引物序列为：上游引物5′－CTGGATATCATGGGGTCACACGGCAAGCC－3′，下游引物5′－GGACTAGTTCATTGAACATACGAGTGATC－3′，PCR扩增参数为94℃，5min；94℃，45s；68℃，2min，35次循环；72℃，10min。PCR产物长度为1851bp。

Southern杂交以地高辛标记的Ta6－SFT全长为DNA探针，Hind III酶切PCR检测阳性的转基因油菜基因组DNA，参照Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection starter KitⅠ（货号：11745832001）说明书操作。Northern斑点杂交以Ta6－SFT全长为DNA探针，将Southern杂交呈阳性的转基因植株的总RNA变性后固定在尼龙膜上，杂交、免疫检测等步骤同Southern杂交。

1.4 T1代转基因植株的PCR检测

收获Southern杂交和Northern斑点杂交均呈阳性的转基因植株种子，按株系种植于转基因温室试验田。等T1代转基因植株长至3～4片真叶时，以25mg/L的ppt进行涂抹筛选，提取抗性植株基因组DNA，用Ta6－SFT特异引物进行PCR检测。统计25mg/L ppt作为筛选浓度的阳性率，阳性率＝（PCR检测阳性株数/抗性植株总数）×100% 。

1.5 T1代转基因植株的抗旱性分析

转基因植株的抗旱性试验于2013年6月在甘肃省农业科学院生物技术研究所转基因专用温室内进行。取长势一致的PCR检测阳性的5－7株系的7株 T1代转基因植株（编号分别为5－7－11，5－7－14，5－7－15，5－7－16，5－7－22，5－7－24和5－7－26，简写为11，14，15，16，22，24和26）进行干旱胁迫处理。参试植株生长于同一块试验地内，进行统一管理。苗期正常浇水，进入抽薹期时停止浇水，开始干旱胁迫，36d后复水。分析干旱胁迫36d和复水后2d各植株中Ta6－SFT的转录水平差异。测定同时期各转基因植株的果聚糖含量、丙二醛含量和细胞质膜透性。

提取干旱胁迫36d和复水后2d各转基因植株和非转基因对照叶片总RNA，参照Invitrogen GoldScript cDNA合成试剂盒（货号：c81401190）合成cDNA第一链。以油菜actin为内参基因，采用半定量RT－PCR分析Ta6－SFT在干旱胁迫不同时期的转录水平表达。油菜actin基因上游引物5′－ATGGCCGATGGTGAGGACATTC－3′，下游引物5′－GGTGCGACCACCTTGATCTTC－3′。Ta6－SFT引物同前。

取干旱胁迫36d和复水后2d各转基因植株和非转基因对照同一叶位叶片，利用GENMED植物果聚糖化学比色法定量检测试剂盒（货号：GMS19023.1v.A）测定果聚糖含量，参照《植物生理学实验指导》电导法测定细胞质膜透性和硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA含量［13］。每个指标测定做3次重复。

1.6 数据分析

利用Microsoft Excel软件绘图，并用DPS 7.05软件利用SSR法进行多重比较。

图2 转基因油菜植株的PCR检测结果Fig.2 PCR detection results of transgenic plants

2 结果与分析

2.1 T0代转基因油菜的分子检测

进行了Ta6－SFT对油菜5个纯系材料的遗传转化，获得PCR检测的3个纯系的转基因植株26株，各品系分别为：1号2株（编号1－1，1－2），2号10株（编号2－1，2－2，……，2－10），5号14株（编号5－1，5－2，……，5－14）（图2）。Southern杂交分析了11份T0代转基因油菜植株，确定其中8株中Ta6－SFT已整合进油菜基因组中（图3），Northern斑点杂交确定其中7株中Ta6－SFT得到了转录 （图4）。

图3 转基因植株的Southern杂交部分结果Fig.3 Southern blot of transgenic plants

图4 转基因植株的Northern斑点杂交Fig.4 Northern dot blot of transgenic plants

2.2 T1代转基因植株的草胺膦抗性筛选和PCR检测

以ppt 25mg/L为涂抹浓度，7个转基因株系筛选出89株抗性植株，PCR检测有16株中扩增出1851bp的Ta6－SFT（图5）目的基因。25mg/L ppt作为筛选浓度的阳性率为17.9%。

2.3 T1代转基因植株的抗旱性分析

2.3.1 干旱胁迫时转基因植株中Ta6－SFT转录水平的表达分析 干旱胁迫36d时，Ta6－SFT在各转基因植株中的表达水平不一致，其中11、15、16和26中表达水平高于其他转基因植株，未转基因对照中没有Ta6－SFT的表达；复水2d后，各植株中Ta6－SFT基因的表达基本一致，都是微量表达（图6），这与逆境诱导型的rd29A启动子的功能相一致。

2.3.2 干旱胁迫时转基因植株中果聚糖含量变化 与Ta6－SFT表达相对应地，在干旱胁迫36d时，11、15、16和26的果聚糖含量高于其他转基因植株和未转基因对照，以16最高（33.4mg/g），其次是15（28.8mg/g）、26（27.9mg/g）和11（27.0mg/g），14（18.0mg/g）、22（19.6mg/g）和24（18.5mg/g）果聚糖含量相对较低。复水2d后，各转基因植株中Ta6－SFT都有微量表达，但果聚糖含量并没有相应地降低却有小幅升高（图7），推测可能是与果聚糖积累和代谢反应速度有关。不论是干旱胁迫36d还是复水后2d，各转基因叶片内的果聚糖含量显著高于非转基因对照，具有极显著差异。

2.3.3 干旱胁迫对转基因植株相对电导率和丙二醛含量的影响 干旱胁迫36d时各转基因植株的相对电导率低于对照，其中15、16、26和11的电导率与对照形成极显著差异，说明这些转基因植株在干旱胁迫下的细胞膜稳定性较好，膜结构没有受到严重的破坏。这与同时期的果聚糖含量相反，说明干旱胁迫下果聚糖含量高的转基因植株的细胞膜结构的稳定性相对较好。复水后，各植株包括未转基因对照的相对电导率大幅降低，各转基因植株的相对电导率仍低于对照（图8）。

图5 T1代转基因油菜植株的PCR分析电泳图Fig.5 PCR detection results of transgenic plants of T1generation

图6 干旱胁迫时转基因油菜半定量RT－PCR分析Fig.6 Semi－quantitative RT－PCR of transgenic plants under drought stress

图7 干旱胁迫对油菜转基因植株果聚糖含量的影响Fig.7 Fructan concentration of the transgenic plants under drought stress

图8 干旱胁迫对油菜转基因植株相对电导率的影响Fig.8 Relative conductivity of transgenic plants under drought stress

干旱胁迫36d和复水2d时各转基因植株的丙二醛含量均显著低于对照，具有极显著差异。复水2d后，各植株包括未转基因对照的丙二醛含量变化出现两种不同趋势，对照、22、24和26复水后丙二醛含量持续上升，11、14、15、16复水后丙二醛含量小幅降低（图9）。分析原因有可能是与丙二醛对逆境的响应慢有关。

图9 干旱胁迫对油菜转基因植株丙二醛含量的影响Fig.9 MDA content of transgenic plants under drought stress

3 讨论

在果聚糖转基因研究中，无论细菌来源的果聚糖蔗糖酶基因（sacB）还是植物来源的果糖基转移酶基因（1－SST，1－FFT，6－SFT，6G－SFT），在转入植物 体内表达后都检测到了很低浓度的果聚糖积累。为了提高转基因植物体内果聚糖含量，研究者采用了各种方法以增强基因表达水平，如采用翻译增强子A1MV RNA4与 CaMV 35S启动子串联［14］，玉米（Zeamays）ubiquitin启动子驱动目的基因［15］，B33块茎特异性启动子［16］等特异性启动子，还有在果聚糖合成酶基因前加入各种类型的亚细胞定位序列等，但都没有取得显著效果。Caimi等［17］曾将果糖基转移酶基因置于化学诱导性启动子控制下，虽然叶片中果聚糖的含量显著提高了，但植物组织结构在36h内逐渐破坏。所以，普遍认为，只有低水平表达果聚糖的转基因植株才能存活，高含量的果聚糖对转基因植株具有致死效应［18］。推测这可能与果聚糖合成的底物是蔗糖有很大关系。蔗糖是光合作用的重要产物，是多数植物体内长距离运输碳水化合物的主要形式，是果聚糖合成的唯一底物。如果在植物体内无限制的合成果聚糖，势必会影响植物体内碳代谢的其他途径。在本研究中，为了发挥果聚糖在植物遭受逆境时的作用而又不造成物质能量的无为消耗和对受体植物的伤害，Ta6－SFT被置于逆境诱导型的rd29A启动子控制下。干旱胁迫36d时，各转基因植株中Ta6－SFT基因活跃转录，11、15、16和26的转录水平高于其他转基因植株，未转基因对照中没有Ta6－SFT的转录。复水2d后，各转基因植株中Ta6－SFT基因都有微量表达，这与rd29A启动子的转录特性相一致。本研究中转基因油菜植株中都检测到了果聚糖的积累（最高浓度为34.4mg/g），转基因植株形态和育性正常，未观察到不良性状，说明所选用的载体和启动子能使目的基因在油菜中有效表达，对受体植物没有产生不利影响。

高翔等［19］将从扬麦6号小麦品种中克隆出的果聚糖合成酶基因Ta6－SFT转入烟草，并对转基因植株进行了抗旱、抗盐和抗低温鉴定，转Ta6－SFT的烟草植株表现出较强的抗旱、抗盐和抗低温能力。殷桂香等［20］进一步讨论了植物中FBEs（果聚糖合成酶基因）结构特点，分析了小麦中FBEs的拷贝数、染色体定位及亚细胞定位等，并对小麦Ta6－SFT进行了亚细胞定位预测，发现液泡中存在其定位信号。Bie等［21］将Ta6－SFT、Ta1－SST和 Ta1－FFT，共转化烟草，获得转单基因（Ta1－SST、Ta1－FFT、Ta6－SFT）、双基因（Ta1－SST＋Ta1－FFT、Ta1－SST＋Ta6－SFT、Ta1－FFT＋Ta6－SFT）和三基因（Ta1－SST＋Ta1－FFT＋Ta6－SFT）植株，进行抗逆鉴定和生理指标测定分析，结果证明共表达Ta1－SST＋Ta6－SFT的转基因烟草中果聚糖含量高于这3个任意一单个基因或其他任两个或三个基因组合，但转化单个小麦果聚糖合成酶基因与转化多个小麦果聚糖合成酶基因在提高烟草植株抗旱性方面无明显差异。叶兴国等［22］研究发现果聚糖的有效积累可提高小麦的抗旱能力，在水分胁迫处理前15d内果聚糖积累量较低，水分胁迫21～28d果聚糖开始积累，随着复水后干旱胁迫解除，果聚糖含量下降。李淑洁等［23］将rd29A启动子驱动的Ta6－SFT的转基因烟草株系和CaMV 35S启动子驱动的转基因株系进行为期18d的干旱胁迫，分析了干旱胁迫0d和干旱胁迫18d不同转基因株系中Ta6－SFT的转录水平表达差异，果聚糖含量以及抗旱相关生理指标，确定rd29A启动子驱动的Ta6－SFT的转基因烟草株系比CaMV 35S启动子驱动的转基因株系更抗旱。本研究以rd29A启动子驱动的Ta6－SFT进行油菜的转化，获得的转Ta6－SFT的T1代转基因油菜植株的果聚糖含量与其抗旱性呈正相关，即果聚糖含量高的植株受到的干旱胁迫相对较小，可能植物果聚糖含量在一定浓度范围内（可称之为有效浓度）即可起到减轻干旱胁迫的作用。

在干旱胁迫下，植物代谢发生紊乱，体内活性氧产生与清除的代谢平衡被破坏，植物细胞内积累大量活性氧并引发膜脂过氧化，造成膜系统的损伤及膜脂过氧化程度的加剧。相对电导率和丙二醛含量常用来判断植物受胁迫时细胞膜的稳定性和受损伤程度。俞乐等［24］通过比较干旱胁迫不同时期细叶结缕草（Zoysiatenuifolia）和日本结缕草（Zoysiajaponica）的叶片相对含水量、电导率和丙二醛含量变化，得出细叶结缕草在干旱胁迫下叶片细胞膜受损程度较小，细胞膜结构稳定性相对较强，对干旱胁迫的适应能力较强。贾学静等［25］研究了干旱胁迫对金心吊兰（Chlorophytumcapensevar.medio－pictum）叶片活性氧及其清除系统的影响，发现当金心吊兰体内活性氧产生与清除系统之间的平衡被破坏后，作为膜脂过氧化产物的MDA含量急剧上升。李州等［14］研究不同叶型白三叶（Trifoliumrepens）抗氧化保护及渗透调节生理对干旱胁迫的响应，认为小叶型白三叶比大叶型之所以具有较好的抗旱性，一方面在于它在干旱胁迫过程中具有良好的清除氧胁迫的能力，另一方面是它能够保持相对较高的渗透调节作用。本研究中转基因植株11、14、15和26在干旱胁迫36d时果聚糖含量高于其他转基因植株，同时期相对电导率和丙二醛含量也较低，说明果聚糖含量高的转基因植株在干旱胁迫时细胞膜稳定性好，膜损伤小，推测果聚糖作为渗透调节物质在其响应干旱的过程中发挥了作用。

4 结论

果聚糖是Ta6－SFT的表达产物，为了发挥果聚糖在植物遭受逆境时的作用而又不造成物质能量的无为消耗和对受体植物的伤害，本研究进行了rd29A启动子驱动的Ta6－SFT对甘蓝型油菜纯系材料的遗传转化，获得经PCR、Southern杂交和Northern斑点杂交验证的转基因植株。对7株T1代转基因油菜进行了为期36d的干旱胁迫，分析干旱胁迫36d和复水后2d各植株及野生型对照中的Ta6－SFT的转录水平表达和果聚糖含量，同时进行同时期丙二醛含量和细胞质膜透性测定。结果表明，Ta6－SFT的转录水平表达与转基因植株体内的果聚糖含量、转基因植株的抗旱性呈正相关，表明Ta6－SFT在干旱胁迫下的表达增强了转基因植株的抗旱性。

［1］ Van der Meerl M，Ebskamp M J M，Visser R G F，etal.Fructan as a new carbohydrate sink in transgenic potato plants［J］.Plant Cell，1994，6（4）：561－570.

［2］ Ebstkamp M J M，Van der Meer I M，Spronk B A，etal.Accumulation of fructose polymers in transgenic tobacco［J］.Bio－Technology，1994，12（3）：272－275.

［3］ Henson C A，Livingston D P III.Characterization of a fructan exohydrolase purified from barley stems that hydrolyzes multiple fructofuranosidic linkages［J］.Plant Physiology and Biochemistry，1998，36：715－720.

［4］ Kawakami A，Sato Y，Yoshida M.Genetic engineering of rice capable of synthesizing fructans and enhancing chilling tolerance［J］.Journal of Experimental Botany，2008，59：793－802.

［5］ Kawakami A，Yoshida M.Molecular characterization of sucrose：sucrose 1－fructosyltransferase and sucrose：fructan 6－fructosyltransferase associated with fructan accumulation in winter wheat during cold hardening［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2002，66（11）：2297－2305.

［6］ Hellwege E M，Gritscher D，Willmitzer L，etal.Transgenic potato tubers accumulate high levels of 1－kestose and nystose：functional identification of a sucrose sucrose 1－fructosyltransferase of artichokeCynarascolymusblossom discs［J］.Plant Journal，1997，12：1057－1065.

［7］ Hellwege E M，Raap M，Gritscher D，etal.Differences in chain－length distribution of inulin fromCynarascolymusandHelianthustuberosusare reflected in a transient plant expression system using the respective 1－FFTcDNAs［J］.FEBS Lett，1998，427：25－28.

［8］ Van der Meer I M，Koops A J，Hakkert J C，etal.Cloning of fructan biosynthesis pathways of Jerusalem artichoke［J］.Plant Journal，1998，15：489－500.

［9］ Sévenier R，Hall R D，Van der Meer I M，etal.High level fructan accumulation in transgenic sugur beet［J］.Nature Biotechnology，1998，16：843－846.

［10］ 李慧娟，尹海英，张学成，等.转蔗糖：蔗糖－1－果糖基转移酶基因提高烟草的耐旱性［J］.山东大学学报（理学版），2007，42（1）：89－93.

［11］ 张小芸，何近刚，孙学辉.转果聚糖合成关键酶基因多年生黑麦草的获得及抗旱性的提高［J］.草业学报，2011，20：111－118.

［12］ 李淑洁，王红梅，张正英.半夏凝集素基因对油菜的遗传转化及REAL TIME PCR分析［J］.作物杂志，2010，（4）：52－55.

［13］ 薛应龙.植物生理学实验手册（第1版）［M］.上海：上海科学技术出版社，1985：67.

［14］ 李州，彭燕，苏星源.不同叶型白三叶抗氧化保护及渗透调节生理对干旱胁迫的响应［J］.草业学报，2013，22（4）：257－263.

［15］ Ye X D，Wu X L，Zhao H，etal.Altered fructan accumulation in transgenicLoliummultiflorumplants expressing aBacillussubtilissacBgene［J］.Plant Cell Reports，2001，20：205－212.

［16］ Caimi P G，McCole L M，Klein T M，etal.Fructan accumulation and sucrose metabolism in transgenic maize endosperm expressing aBacillusamyloliquefacienssacBgene［J］.Plant Physiology，1996，110：355－363.

［17］ Caimi P G，McCole L M，Klein T M，etal.Cytosolic expression of theBacillusamyloliquefaciensSacBprotein inhibits tissue development in transgenic tobacco and potato［J］.New Phytologist，1997，136：19－28.

［18］ Cairns A J.Fructan biosynthesis in transgenic plants［J］.Journal of Experimental Botany，2003，54：549－567.

［19］ 高翔，佘茂云，殷桂香，等.小麦果聚糖合成酶基因6－SFT克隆和功能验证［J］.科技导报，2009，23：70－75.

［20］ 殷桂香，佘茂云，高翔，等.植物果聚糖合成酶基因克隆及特性分析［J］.中国生物工程杂志，2009，29（2）：125－133.

［21］ Bie X M，Wang K，She M Y，etal.Combinational transformation of three wheat genes encoding fructan biosynthesis enzymes confers increased fructan content and tolerance to abiotic stresses in tobacco［J］.Plant Cell Reports，2012，31：2229－2238.

［22］ 叶兴国，高翔，佘茂云，等.小麦中果聚糖合成酶基因与抗旱性关系及其分子生物学研究［A］.全国植物分子育种研讨会摘要集［C］.北京：中国作物学会，2009：57.

［23］ 李淑洁，李静雯，张正英.Ta6－SFT在烟草中的逆境诱导型表达及抗旱性分析［J］.作物学报，2014，40（6）：994－1001.

［24］ 俞乐，刘拥海，周丽萍，等.干旱胁迫下结缕草叶片抗坏血酸与相关生理指标变化的品种差异研究［J］.草业学报，2013，22（4）：106－115.

［25］ 贾学静，董立花，丁春邦，等.干旱胁迫对金心吊兰叶片活性氧及其清除系统的影响［J］.草业学报，2013，22（5）：248－255.