天名精内酯酮的抑菌活性

韩兴帅，许 丹，冯俊涛,2，张 兴,2

(1 西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心，陕西 杨凌 712100；2 陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

从植物中寻找具有农药活性的物质，特别是具有新型分子结构的化合物是当前新型农药创制的一条重要途径，亦是发掘新一代农药先导化合物的有效方法之一[1]。菊科植物以其种类多样，化学成分复杂，成为植物源杀菌剂研发的主要目标植物类群之一[2-4]。

西北农林科技大学无公害农药研究服务中心对西北地区多种菊科植物进行了杀菌活性的筛选[5-6]，发现菊科天名精属植物大花金挖耳(CarpesiummacrocephalumFranch.Et Sav)具有较强的杀菌活性，从中分离到17种化合物，经测试、分析认为半萜内酯类化合物天名精内酯酮(图 1)为其主要活性成分之一,研究发现天名精内酯酮具有较为广谱和较强的杀菌活性[7]。在此基础上，本文以小麦纹枯病菌、番茄灰霉病菌、番茄叶霉病菌、南瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌、苹果干腐病菌、小麦条锈病菌和辣椒疫霉病菌为供试病原菌，采用生长速率法、孢子萌发法、盆栽药效试验及组织法，从离体和活体2个方面评价了天名精内酯酮的杀菌活性，以期为这一植物源活性物质的开发利用提供基础资料。

图 1 天名精内酯酮的结构

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试药剂：天名精内酯酮(纯度≥96%)、10%天名精内酯酮微乳剂，均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供；15%粉锈宁可湿性粉剂(四川国光农化有限公司)，70%甲基硫菌灵可湿性粉剂 (陕西上格之路生物科学有限公司)，50%甲霜灵可湿性粉剂(中国潍坊市瑞泽丰农化有限公司)，50%速克灵可湿性粉剂(日本住友化学工业株式会社)。

供试病原菌：小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄叶霉病菌(Fulviafulva(Cooke)Ciferri)、南瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum(Schl.) f.sp.cucumerirtumOwen)、黄瓜炭疽病菌(Colletrichumlagenarium(Pass.)Ell.et Halst)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)、小麦赤霉病菌(Gibberellasanbinetti)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulate)、苹果干腐病菌(Botryosphaeriaberengeriana(Moug.ex fr).Ces. etdeNot)、小麦条锈病菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)和辣椒疫霉病菌(PhytophthoracapsiciLeonian)，均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。

供试作物：小麦(品种为辉县红)、黄瓜(品种为农城3号)和辣椒(品种为世纪红)，均为感病品种，购自杨凌种子市场。番茄果实采摘自陕西杨凌杨村温室大棚。

1.2 试验方法

前期初步测试表明，天名精内酯酮对小麦纹枯病菌、番茄灰霉病菌、番茄叶霉病菌、辣椒疫霉病菌、南瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌和苹果干腐病菌10种病原菌菌丝生长具有较强的抑制作用，对小麦赤霉病菌、黄瓜炭疽病菌、番茄灰霉病菌、番茄叶霉病菌和辣椒疫霉病菌5种病菌孢子的萌发具有较高的抑制效果，故离体毒力测定中分别选取上述病原菌进行测试。

1.2.1 离体测定方法 (1) 生长速率法。采用生长速率法测定天名精内酯酮对供试病菌菌丝生长的抑制作用[8]。在无菌条件下，将PDA培养基融化，待用。在含9 mL 培养基的具刻度试管中加入1 mL用丙酮溶解的不同质量浓度的天名精内酯酮溶液, 将其充分摇匀后倾倒于直径为9 cm 的培养皿中, 制成平板培养基备用，天名精内酯酮的终质量浓度分别为2，4，16，32，64 mg/L。将直径为4 mm的供试病原菌菌饼分别接种于含有不同质量浓度天名精内酯酮的带毒培养基平板上，置于室内(温度(25±1) ℃，相对湿度70%～80%)培养。每皿为1个处理，每处理3次重复。以等量丙酮处理为对照，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率和有效抑制中浓(EC50)。

菌落直径=菌落平均直径-4×菌饼直径；

抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

(2)孢子萌发法。采用悬滴法[8]测定天名精内酯酮对供试病菌孢子萌发的抑制毒力。用无菌水将培养好的供试病菌孢子从产孢培养基上洗下，用纱布过滤得到孢子悬浮液，以无菌水调至1×106mL-1。向孢子悬浮液中加入不同质量浓度的天名精内酯酮溶液，制备5个药剂质量浓度梯度的带药孢子混合液，每个质量浓度处理设置3个重复。吸取带药孢子混合液50 μL滴加在凹玻片上，25 ℃恒温箱中保湿培养，在显微镜下观察分生孢子萌发情况，以芽管长度大于孢子短半径认定为萌发，当对照萌发率大于80%后，检查所有处理的萌发率，计算孢子萌发抑制率和有效抑制中浓(EC50)。

萌发率=萌发孢子数/检查孢子总数×100%；

抑制率=(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100%。

1.2.2 活体测定方法 (1)防治小麦全蚀病盆栽试验。采用Penrose[9]的菌饼接种法，并略有修改：将小麦播种于装有灭菌土的直径10 cm的塑料花盆中，每盆15株左右，待长至2～3叶时开始试验。将菌饼与幼苗根部四周1～2 cm深的土壤轻微混拌接菌，每株幼苗根部接种2个菌饼。将天名精内酯酮配制成质量浓度分别为1 000和500 mg/L的2个溶液，以10 mL注射器进行注射灌根施药，施药量为10 mL/盆。保护作用测定：施药24 h 后进行接菌，保持相对湿度在80%以上培养。治疗作用测定：先对小麦进行接菌，保持相对湿度80%以上，48 h 后施药。以灌施10 mL粉锈宁150 mg/L的药液处理为标准药剂对照，每处理重复4次；同时设清水和溶剂对照。接种3周后，洗根调查发病情况。

(2)防治小麦条锈病盆栽试验。将供试小麦种子消毒、浸种、催芽后盆栽，每盆种植15株左右；待小麦幼苗第1片叶完全展开时进行试验。保护作用测定时，用喷雾法施药，24 h后再用扫接法接菌保湿24 h，然后转入常规管理；治疗作用测定时，先接菌，保湿24 h后再施药[10]。将天名精内酯酮配制成质量浓度分别为1 000，500 mg/L；以清水为空白对照，以粉锈宁150 mg/L处理为标准药剂对照。每处理重复4次，接种7 d后调查发病情况。

(3)防治黄瓜炭疽病盆栽试验。参照《农药室内生物测定试验准则》进行[11]，具体为：待黄瓜幼苗长到2～4片真叶时备用。将孢子悬浮液(1×105mL-1)喷在植株叶面接菌，以叶面布满雾点而不形成水滴流失为宜；保护性试验在药剂处理后24 h 接菌，治疗性试验在药剂处理前24 h 接菌；接菌后保持相对湿度95%～100%、黑暗培养24 h，然后在 22～27 ℃、相对湿度80%～90%条件下光照培养。将天名精内酯酮配制成质量浓度分别为1 000，500 mg/L；以清水为空白对照，以甲基硫菌灵700 mg/L处理为标准药剂对照。每处理重复4次，每重复育苗3盆。14 d后进行病情调查。

(4)防治辣椒疫霉病盆栽试验。参照邱思鑫等[12]的方法，具体为：待盆栽辣椒长出4～6片叶时开始试验。采用灌根方式进行接种，每盆接种5 mL 药液或辣椒疫霉病菌孢子悬浮液(1×105mL-1)，同时设清水对照。保护作用为先将药液浇灌在根际周围，24 h 后浇灌辣椒疫霉病菌孢子悬浮液；治疗作用为先浇灌辣椒疫霉病菌孢子悬浮液，24 h 后浇灌药液。每个处理育苗3 盆，4次重复。将天名精内酯酮配制成质量浓度分别为1 000，500 mg/L；同时设清水和溶剂对照，以甲霜灵500 mg/L处理为标准药剂对照。于接种后14 d调查发病情况。

上述各试验发病情况均按《农药田间药效试验准则》中病害分级标准[13]进行调查，按照下式计算病情指数和药效[14]：

病情指数=∑(各级病株数或叶数×对应发病级数)/(调查总株数或叶数×最高发病级数)×100；

药效=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%。

(5)防治番茄灰霉病药效试验。番茄灰霉病药效试验采用番茄幼果法[15]。将从田间采集的未施用任何杀菌药剂的番茄果实先用清水洗涤干净、晾干，再用脱脂棉醮取体积分数75%的乙醇擦拭果实表面。用接种针在番茄果实表面刺出直径约5 mm的侵染区域，以直径4 mm的打孔器打制菌饼，将菌饼倒扣在番茄果实表面病菌侵染区。保护作用：先采用喷雾法，将质量浓度分别为500和 1 000 mg/L的天名精内酯酮药液直接洒在番茄果实表面，待药液晾干后接菌。治疗作用：先将菌饼接种在番茄果实表面后，再以质量浓度分别为500和 1 000 mg/L的天名精内酯酮药液喷洒果实表面。以丙酮溶液处理为溶剂对照，以500 mg/L速克灵处理为标准药剂对照。接种后于25 ℃培养箱中保湿培养，3 d后检查发病情况，计算药效。

药效=(对照病斑扩展直径-处理病斑扩展直径)/对照病斑扩展直径×100%。

上述试验数据均采用SPSS(19.0)软件中邓肯氏新复极差法(DMRT)进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 天名精内酯酮对供试病菌的离体生物测试结果

2.1.1 对10种病原真菌菌丝生长的抑制作用 采用生长速率法测定了天名精内酯酮对10种病原真菌菌丝生长的抑制作用，结果见表1。由表1可见，天明精内酯酮对供试的10种病原真菌菌丝生长均具有较强的抑制作用， EC50在 4.894 7～43.856 9 mg/L。其中对小麦全蚀病菌的毒力最高，EC50为4.894 7 mg/L，对小麦纹枯病菌的毒力次之，EC50为12.640 9 mg/L，对辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜炭疽病菌和苹果干腐病菌均具有中等毒力，EC50在20～25 mg/L，对番茄灰霉病菌、番茄叶霉病菌、苹果炭疽病菌和南瓜枯萎病菌的毒力较弱，EC50>30 mg/L。

表 1 天名精内酯酮对10种病原真菌菌丝生长的抑制毒力(5 d)

2.1.2 对5种病原真菌孢子萌发的抑制作用 采用孢子萌发法测定了天名精内酯酮对5种病原真菌孢子萌发的抑制毒力，结果见表2。由表2可知，天明精内酯酮对供试的5种病原真菌孢子萌发均具有一定的抑制作用，但对不同病原菌孢子萌发的抑制作用存在明显差异。其中对黄瓜炭疽病菌孢子萌发的抑制毒力最高，EC50为6.876 5 mg/L，对辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄叶霉病菌也具有较强的抑制作用，EC50在22.733 0～37.817 3 mg/L，而对小麦赤霉病菌孢子的抑制作用相对较弱，EC50大于200 mg/L。

表 2 天名精内酯酮对5种病原真菌孢子萌发的抑制毒力

2.2 天名精内酯酮对5种病害的药效试验结果

2.2.1 对4种植物病害的盆栽药效 由表3可知，天名精内酯酮对小麦全蚀病的药效相对较好。在 1 000 mg/L剂量下，天名精内酯酮对小麦全蚀病的保护效果和治疗效果分别为85.48%和64.98%，保护效果优于粉锈宁150 mg/L处理(82.28%)；在500 mg/L剂量处理下的保护效果仍可达74.65%，而此质量浓度下治疗效果为47.08%，明显下降。天名精内酯酮对小麦条锈病的药效次之，1 000 mg/L 剂量下的保护和治疗效果分别为60.40%和59.70%，均显著低于对照药剂粉锈宁150 mg/L的处理，而500 mg/L剂量下的保护和治疗效果分别只有30.60%和15.27%。天名精内酯酮对黄瓜炭疽病和辣椒疫霉病的药效较低，1 000 mg/L剂量下的保护效果分别为50.01%和48.06%，治疗效果分别为46.49%和39.75%，均显著低于对照药剂，500 mg/L剂量下的保护和治疗效果则均不足30%。

表 3 天名精内酯酮对4种植物病害的盆栽药效

2.2.2 对番茄灰霉病的室内药效 由表4可见，天明精内酯酮对番茄灰霉病防效较低，1 000 mg/L处理的保护效果和治疗效果分别为45.5%和19.9%，500 mg/L剂量下仅表现出较低的保护效果 23.9%，无明显治疗效果。

表 4 天明精内酯酮对番茄灰霉病的防治效果

3 小结与讨论

本研究表明，天名精内酯酮对供试病原真菌均表现出较好的抑制作用和一定的广谱性，具有开发为植物源杀菌剂的潜质。天名精内酯酮在大花金挖耳、天名精等菊科植物中含量较高，主要分布于植株花序中[16]。前期已对大花金挖耳的杀菌活性进行了系统研究，通过对比大花金挖耳全株及根、茎、叶和花提取物的抑菌活性，发现活性成分主要集中在花中，且主要存在于乙酸乙酯和乙醇相中，茎、叶提取物活性较低，活性成分存在于石油醚和氯仿相中[17]。大花金挖耳丙酮提取物对苹果炭疽病的抑制侵染率为 63.50%，对黄瓜霜霉菌的保护作用和治疗作用均在50% 以上，对小麦白粉病的保护和治疗效果均高于60%[5,17-18]，大花金挖耳精油对小麦全蚀病菌和小麦纹枯病菌菌丝生长的抑制作用大于97%[19]。活性成分研究表明，天名精内酯酮是大花金挖耳的主要杀菌活性物质之一[7]。任双喜等[20]研究发现，天名精内酯酮对小麦白粉病菌菌落的扩展具有明显抑制作用，对小麦白粉病具有保护和治疗双重效果，且灌根处理对小麦白粉病有较好的防效，说明天名精内酯酮具有较优的内吸传导性能。本研究中天名精内酯酮对供试的11种所属不同分类地位的病原真菌均表现出较好的离体或活体抑菌活性，这些病原真菌包括半知菌亚门5种，子囊菌亚门4种，担子菌亚门和鞭毛菌亚门各1种。其中，天名精内酯酮对小麦全蚀病菌菌丝生长的EC50为4.894 7 mg/L，对黄瓜炭疽病菌孢子萌发的EC50为6.876 5 mg/L， 1 000 mg/L剂量下对小麦全蚀病的保护效果和治疗效果分别为85.48%和64.98%，说明天名精内酯酮具有较强的杀菌活性，并具有一定的广谱性，具备进一步研究的价值。尤其对小麦全蚀病菌在离体和活体测定中均表现出了较高的杀菌活性，在后续的研究中应当予以重视。

天名精内酯酮的来源植物资源分布广泛，具备从多种途径开发应用的潜质。首先，可直接从植物中分离提取天名精内酯酮。天名精内酯酮是广泛存在于菊科天名精属植物中的倍半萜内酯类化合物，在植株的花、茎叶及根中均有分布，目前已在烟管头草[21]、大花金挖耳[22]、天名精[16]等天名精属植物中分离得到。天明精属(CarpesiumL.)植物属于菊科(Compositae)旋复花亚族，为多年生草本植物。该属共有21种，大部分分布于亚洲中部，特别是我国西南山区，少数种类广布欧、亚大陆，我国有17种，3变种[23]。其次，在合理开发自然资源的前提下，对天名精内酯酮的开发利用也可从人工合成和生物合成2个方面进行。通过利用现代化学技术和手段，研究、开发其化学合成工艺，实现天名精内酯酮的人工全合成，并在此基础上适当进行结构修饰，有望获得更加优异的杀菌活性化合物；通过利用植物组织培养、细胞培养及植物内生菌发酵等技术实现天名精内酯酮的生物合成，天明精内酯酮属倍半萜类物质，萜类化合物虽然形态各异，但均是由异戊二烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)聚合而成[24-25]。目前对该生物合成的途径和步骤逐渐清晰，许多关键酶的基因被克隆分离，尤其是萜类合成酶研究进展较快，已有多种萜类生物合成的关键酶晶体结构的报道[26-27]，这预示着天明精内酯酮的生物合成将指日可待。

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