SEC-HPLC法测定重组人生长激素注射液中苯酚含量

陆春燕， 李增礼， 王荣海,2， 宋礼华,2

(1. 安徽安科生物工程(集团)股份有限公司， 合肥 230088； 2. 安徽省生物研究所， 合肥 230088)

重组人生长激素能够调节代谢、刺激蛋白质合成和加速脂肪代谢，其制剂在临床上主要用于治疗儿童因内源性生长激素缺乏或不足而导致的身材矮小症[1]。重组人生长激素注射液中通常加入苯酚、苯甲醇或间甲酚作为抑菌、抗氧化辅料。苯酚过量，对人体有害，如可抑制中枢神经或损伤肝、肾功能等，因此定量检测重组人生长激素注射液中苯酚的含量是质控指标之一[2-5]。2010版《中国药典》[6]和现行欧洲药典[7]对苯酚的测定均采用滴定法，该方法步骤多操作繁琐；本实验采用的高效液相色谱法在同一条件下可同时进行重组人生长激素含量和高分子蛋白质的分析，可有效分离苯酚、重组人生长激素及其高分子蛋白质，该方法操作简单快捷，无需额外的检测仪器、色谱柱和流动相，能极大的节约分析时间和分析成本。

1 仪器与材料

岛津LC-10AT型液相色谱仪(日本岛津公司)，重组人生长激素注射液为安徽安科生物工程(集团)股份有限公司产品(批号：20100524,20100527,20100601)；苯酚对照品购自Sigma公司(含量>99.5% ，批号：MKBB0860)；异丙醇为色谱纯，购自TEDIA公司；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:TSK G2000SWxL(7.8×300 mm，5 μ)；流动相:异丙醇-0.063mol/L PB(pH值7.0)=3：97，；检测波长为214 nm；流速:0.6 mL/min；柱 温:25℃[6]。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取苯酚约250 mg置25 mL容量瓶中，用0.025 mol/L(pH值7.0)磷酸盐缓冲液溶解稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中含10 mg苯酚的溶液，作为对照品贮备溶液。

2.3 系统适应性试验

分别取重组人生长激素、组氨酸和苯酚对照品贮备液适量，制成含苯酚3.0 mg/mL的重组人生长激素溶液，取20 μL，按“2.1”色谱条件进样，记录色谱图。结果显示重组人生长激素与组氨酸峰、组氨酸和苯酚之间的分离度分别为7.45和7.05；苯酚峰的理论塔板数为11240，拖尾因子为1.33；峰面积的RSD=0.27(n=5)。表明该分析系统适应性良好。结果见图1和图2。

图2 重组人生长激素注射液

2.4 线性

精密量取“2.2”项对照品溶液1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL和10.0 mL，分别置100 mL容量瓶中，用0.025 mol/L磷酸盐缓冲液溶解稀释至刻度，摇匀，按设定的色谱条件测定。以苯酚浓度值为横坐标(x)，苯酚峰面积为纵坐标(y)进行线性回归。回归方程：y=14189427.8236x+1214880.2317，r=0.99915。表明苯酚在0.10～1.0 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度

精密量取“2.2”项下苯酚对照品溶液5.0 mL置于100 mL容量瓶，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液溶解稀释至刻度，摇匀，同等试验条件下每次进样20 μL，连续进样5次。经计算，苯酚色谱峰面积RSD=0.27%(n=5)。结果表明本色谱系统具有较高的精密度。

2.6 重复性

精密量取“2.1”项下对照品溶液1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL和10.0 mL分别置于100 mL容量瓶中，用0.025 mol/L磷酸盐缓冲液溶解稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件，各取20 μL进样，记录色谱峰面积，制作标准曲线。另取5支(批号：20100527)同一批次重组人生长激素注射液，进样检测和分析，并按外标法计算苯酚含量。苯酚平均含量为3.01 mg/mL，RSD =0.11%(n=5)。结果表明系统重复性良好。

2.7 检测限

取“2.2”项下苯酚对照品溶液适量，制备成浓度分别为0.05 mg/mL、0.005 mg/mL和0.0005 mg/mL溶液，按设定的色谱条件，各取20 μL注入高效液相色谱仪，直至信噪比S/N=3，此时样品浓度即为最低检测限。试验结果表明，在该色谱条件下苯酚最低检测限为0.5 ng/mL。

2.8 回收率

配制成苯酚质量浓度为0.40 mg/mL重组人生长激素溶液。按每份1.0 mL取9份样品溶液，随机分为3组，各组分别准确加入质量浓度分别为0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL苯酚溶液各1 mL，制备成3种浓度的溶液，按设定的色谱条件，各取20 μL进样，记录色谱图。另取“2.2”项下苯酚对照品溶液，制成质量浓度为0.5 mg/mL的苯酚溶液作为对照品溶液，同法进行测定。结果显示，3个水平的平均回收率分别为101.71%，100.71%，102.03%，总平均回收率为101.48%(n=9)，RSD=0.58%。实验结果见表1。结果表明本方法准确可靠。

表1 回收率试验结果

2.9 样品测定

将待检的3批样品6倍稀释制成供试品，取20 μL注入色谱仪，平行进样。另取质量浓度为0.5 mg/mL的苯酚对照品溶液同法测定，并采用外标法计算样品中苯酚的含量。结果见表2。

表2 3批重组人生长激素注射液中的苯酚含量

3 结论

本试验所采用的色谱条件能有效分离苯酚、组氨酸和重组人生长激素，不仅能够检测重组人生长激素中苯酚的含量，而且能同时测定样品中重组人生长激素的含量。可以极大的节约重组人生长激素注射液分析时间与分析成本。另外，与其他RP-HPLC法测定苯酚的含量相比[8-14]，本试验采用的流动相仅含有少量的有机溶剂，对环境造成的危害更小。综上所述本方法环保、准确、快速、可靠，可用于重组人生长激素注射液中苯酚含量的测定。

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