山药食用部分石蜡切片的制作方法和鉴定研究

2014-03-25王耀文王仕玉龙雯虹

山西农业大学学报（自然科学版） 2014年1期

王耀文,王仕玉,龙雯虹

(云南农业大学园林园艺学院，云南昆明 650201)

山药(Dioscoreaopposita)又名土薯、山薯等，薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)，一年生或多年生缠绕性藤本植物，是一种食用和药用利用价值很高的作物。湖北、江苏、河南、云南和贵州等地均有栽培。对山药食用部分人们一般定义为块茎或根状茎，许多书刊均有这样的描述[1,2]，也有一些书刊里将其称为块根[3,4]。根和茎的外观区分主要看其有没有节间，中间有节的为茎，如藕；无节的为根，如萝卜。本试验研究的云南当地品种牛尾山药(D.opposita)食用部分外观似根，没有节间。为了证实山药食用部分是茎还是根，需要对其内部构造进行观察分析，因此，找到适合于山药地下食用部分石蜡切片的制作方法，制作出完整清晰的石蜡切片是观察的关键。

常规石蜡切片制作过程主要有：取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、脱蜡、复水、染色、脱水、透明、封片。每一个环节都是相互关联的，任何一个环节不到位都会影响最终制片的质量[5]。因所取的材料不同，材料中水分、蛋白质、淀粉、脂肪等成分和含量不同，每个步骤所需的时间也不相同。制作石蜡切片能否成功最关键的步骤是脱水、透明和浸蜡，若植物组织中水未脱尽，残留的水分和二甲苯、石蜡不相溶，会使浸蜡和切片失败[6]；透明不彻底则会导致材料不通透以及石蜡不能借助二甲苯进入材料中；浸蜡不充分则石蜡不能完全代替透明剂进入材料组织中，切出的切片会有空洞。无论脱水过度、透明过度还是浸蜡过度，都会引起组织变硬变脆。因此，对山药地下食用部分进行脱水、透明、浸蜡等主要影响因素进行试验，以期找到适合山药地下食用部分的脱水、透明、浸蜡时间，制作出较好的切片。

1 材料与方法

1.1 试验材料

云南省禄丰县牛尾山药(D.opposita)幼嫩地下食用部分。

1.2 取材与固定

FAA固定液的配制：70%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福尔马林5 mL[7]。

挑选整齐、硬实、无病害的山药幼嫩地下部分(直径约0.5 cm)，洗净擦干，切成长约1 cm的茎段，放入有盖的小瓶中，倒入FAA固定液固定。

1.3 脱水与透明

1.3.1 脱水时间试验设计

取出材料进行脱水，设3个处理水平，每个处理4段茎段。

处理1：70%乙醇(1.5 h)→85%乙醇(1.5 h)→95%乙醇(过夜)→无水乙醇Ⅰ(1.5 h)→无水乙醇Ⅱ(1.5 h)；

处理2：除在95%乙醇过夜同处理1外，其余每阶段均设置为2 h；

处理3：除在95%乙醇过夜同处理1外，其余每阶段均设置为2.5 h。

处理后放入二甲苯中检测脱水效果。

1.3.2 透明时间试验设计

将脱水干净又不皱缩的材料设置3个处理水平，每个处理4段根状茎。

处理1：按参考文献[8]中二甲苯作为透明剂的透明步骤进行透明，每个阶段均设置为6 h；

处理2:每个阶段均设置为8 h；

处理3：每个阶段均设置为10 h。

处理后切片检测透明效果。

1.4 浸蜡与包埋

1.4.1 浸蜡时间试验设计

取透明成功的材料设置3个处理水平，每个水平4段根状茎。

处理1：盛有材料的小杯中倒出1/3的二甲苯倒入1/3的熔蜡，加盖放在35℃恒温箱中(8 h)→50℃恒温箱(8 h)→去盖置于60℃恒温箱(8 h)→倒出1/2的溶液倒入1/2的蜡置于60℃恒温箱(8 h)→倒出2/3的溶液倒入2/3的蜡置于60℃恒温箱(8 h)→倒出所有溶液放入纯蜡置于60℃恒温箱(8 h)；

处理2：每个阶段均设置为10 h；

处理3：每个阶段均设置为12 h。

1.4.2 包埋

按参考文献[7]中包埋方法进行包埋。

1.5 切片、粘片

按参考文献[7]中切片方法进行切片(切片厚度为14 μm)，检测浸蜡效果。将完整的蜡片按参考文献[7]中粘片方法进行展片，将其放在45℃左右恒温箱内烤干[9]。

1.6 脱蜡和复水

按参考文献[9]中脱蜡和复水步骤进行。

1.7 染色、脱水

采用番红—固绿对染法[7]，复水之后放入番红溶液中染色(24 h)→50%乙醇(5 min)→70%乙醇(5 min)→85%乙醇(5 min)→固绿溶液(1.5 min)→95%乙醇(5 min)→无水乙醇Ⅰ(5 min)→无水乙醇Ⅱ(3 min)

1.8 透明和封片

切片从无水乙醇Ⅱ中取出放入1/2二甲苯+1/2纯酒精(5 min)→二甲苯Ⅰ(5 min)→二甲苯Ⅱ(5 min)→滴一滴中性树胶→封片→35℃烘箱中烘干。

2 结果与分析

2.1 不同脱水时间对材料脱水效果的影响

由表1可以看出，处理1脱水不完全，二甲苯遇水变成乳白色，且有两段材料出现凹陷。若原材料中的水分不能完全除净，包埋剂和封固剂就不能渗透到组织中，也就不能制作出完整的石蜡切片。而处理3材料出现硬化，脱水过度，3段材料边缘出现褐色，材料硬化后切片时不能形成完整蜡片。处理2脱水时间段比较适宜，有利于完整切片的制作。

表1 不同脱水时间对材料脱水效果的影响

2.2 不同透明时间对材料透明效果的影响

从表2和图1A可以看出，处理1由于透明时间不足，透明感不明显，二甲苯未完全浸入材料，致使包埋剂不能完全渗入组织当中，切片出现皱缩或空洞。处理3和图1C透明过度，引起组织收缩变脆，出现较多碎裂和脱落，切片不完整。图1B切片清晰完整，表明处理2的透明时间适宜，切片完整无损。

表2不同透明时间对材料透明效果的影响

Table2 The transparent situation of material in different transparent time

处理Treats通透情况Transparent case切片完整情况Intact conditionof paraffin处理1(每阶段6 h)不通透皱缩处理2(每阶段8 h)通透完整处理3(每阶段10 h)通透碎裂

图1 不同透明时间对切片效果的影响Fig.1 The effect of different transparent time on result of paraffin section注：A.处理1制作出的石蜡切片;B.处理2制作出的石蜡切片;C.处理3制作出的石蜡切片。Note:A.The paraffin section of first treat; B.The paraffin section of second treat;C.The paraffin section of third treat.

2.3 不同浸蜡时间对切片效果的影响

从表3和图2A看出，处理1浸蜡时间不足，切片有皱褶和破碎、空洞现象，由于浸蜡时间太短，石蜡还不能完全代替二甲苯，切出的蜡带稍碰即碎。处理3经过每级停留12 h的时间，浸蜡时间过长，引起组织硬脆，图2C不完整，出现不同程度的破碎。处理2浸蜡时间为10 h，较为适宜，二甲苯完全挥发，石蜡完全浸入，图2B中蜡带完整，切片清晰。

表3 不同浸蜡时间对切片效果的影响

图2 不同浸蜡时间对切片效果的影响Fig.2 The effect of different dipping wax time on result of paraffin section注：A.处理1制作出的石蜡切片;B.处理2制作出的石蜡切片;C.处理3制作出的石蜡切片。Note:A.The paraffin section of first treat;B.The paraffin section of second treat; C.The paraffin section of third treat.

2.4 材料的显微结构特点

从图3A和B可看出，维管束较多且无规则地分散在组织中，外围表皮(B)的维管束要比中间部位(A)的维管束密集，无明显的髓结构，有初生木质部、初生韧皮部。图3C为边缘一侧细胞较为密集和结构较为特殊的一个部位，向外凸起，初步判断为不定根原基。

从图4A和B可以看出，木质部和韧皮部内外排列，没有形成层。木质部和韧皮部呈两个相反的方向分化，即韧皮部外始式分化和木质部内始式分化。符合植物茎的一般特征。图4C为基本组织放大后的图像，中间有红色颗粒物，初步判断为淀粉粒。

通过对切片的显微观察，维管束排列方式及木质部、韧皮部的分化特点等都符合单子叶植物茎的一般特征，证实山药地下食用部分为变态茎。

图3 10×10倍镜下材料不同部位显微结构Fig.3 10 × 10 magnification in the different parts of the material microstructure注：A.中间含维管束部位； B.外围周皮部位;C.边缘不定根原基部位。Note:A Containing vascular bundles site in the middle; B.Peripheral periderm site；C.Edge adventitious root primordia site.

图4 10×40倍镜下材料不同部位显微结构Fig.4 10 × 40 magnification in the different parts of the material microstructure注：A .某一维管束结构B .某一维管束结构C .基本组织及淀粉粒结构。Note:A. A vascular bundle structure；B.A vascular bundle structure；C.Basic organizational and starch grain structure.

3 结论与讨论

3.1 制作方法

应用酒精脱水时，应逐步进行，不可太快，否则会使细胞收缩。开始脱水时先用浓度较低的酒精，然后逐渐增加浓度以至纯酒精，一般各级酒精浓度为50%、70%、85%、95%、100%[7]。由于配制FAA固定液时是用70%的酒精，所以脱水时从70%酒精开始脱水不会产生影响，同时可以节约时间和试剂。

浸蜡过程中温度过高会引起材料变脆，通常不能高出熔点2℃，并且夏季要适当降低温度。通常粘片时需要使用明胶粘贴剂，但是如果载玻片够干净，用蒸馏水也可进行粘片，不过不同蒸馏水的粘贴效果会有所不同。

3.2 显微结构分析

绝大多数单子叶植物茎维管束很清楚的分开，一般有两种排列方式：一种是维管束全都无规则的分散在基本组织中，愈向外愈多，皮层和髓很难分辨；另一种是维管束排列较规则，一般呈两圈，中央为髓[10]。单子叶植物的根通常没有次生结构，仅由初生结构组成，且维管束占整个根结构的比重较小，处在中间部位，内皮层五面加厚。从图3A和B可以看出，其符合单子叶植物茎的一般特点，因而将其判定为茎。

木质部和韧皮部内外排列，无形成层,维管束中韧皮部外始式分化和木质部内始式分化是大多数单子叶植物茎的结构特征之一[10]。单子叶植物根木质部和韧皮部相间排列且均为外始式发育。从图4A和B可以看出，材料的木质部和韧皮部的分化方式都符合单子叶植物茎的分化方式，由此推断其为茎。

此试验所用的牛尾山药所需的透明和浸蜡时间较长，可能与其所含淀粉较多有关，图4C中可看到一些淀粉粒，一般染色时淀粉不着色，但由于含量太多，部分淀粉已上了色。

膨大的变态茎有根状茎和块状茎两种，主要通过形状来判断。就山药来说，如果呈棍棒状，可称为根状茎，如著名的铁棍山药；如果呈块状或掌状，可称为块状茎，如广州红皮淮山药，福建的观音薯等。此研究材料牛尾山药为棍棒状，因此称其为根状茎。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志(第16(1)卷)[M]．北京：科学出版社，1985:54-55.

[2]黄文华．山药无公害标准化栽培[M]．北京：中国农业出版社，2005:1-3.

[3]周燕琼，赵昶灵，李云，等．云南紫薯蓣块根紫色素化学本质和含量的初步研究[J]．江苏农业科学,2010(4)：183-185.

[4]杜广平,魏树成,杜振宇．土壤耕深对寒地山药生长发育及产量的影响[J]．河南农业，2011(7):70-72.

[5]侯春春，徐水．浅析影响石蜡切片质量的关键因素[J]．中国农学通报，2009,25(23)：94-98.

[6]王静，左幸，黄正文.常规植物石蜡制片技术的改进及应用[J].安徽农学通报，2011,17(11)：36-39.

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[8]段国禄,施江．植物制片、标本制作和植物鉴定[M]．北京：气象出版社，2008:6-14.