脂质体法与电穿孔法转染两种细胞效率的比较＊

张禾璇，单可人，何 燕，张 婷，王婵娟，官志忠

（1.贵州省妇幼保健院优生遗传科，贵阳550001；2.贵州省医学分子生物学重点实验室，贵阳550004）

细胞转染技术是采用一定的途径将外源分子导入细胞、表达目的基因的过程。细胞转染载体有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率高，但由于其转染具有免疫原性和致突变性限制了它的应用；非病毒载体系统具有低毒、低免疫原性、转移的核苷酸大小范围广和相对靶向性等优点。当用化学或物理方法转染某些类型细胞效率不高或有毒性时，电穿孔可能是一种有用的方法[1-2]。目前，非病毒载体转染法中运用最广泛的主要有阳离子脂质体LipofectamineTM2000[3-4]和电穿孔法。选择合适的细胞转染方式，高效率质粒转染肿瘤细胞对于细胞生物学和分子生物学以及肿瘤防治等科学研究有十分重要的意义[5-6]。本研究分别采用脂质体法和电穿孔法转染人肝癌细胞株 HepG2、SGC7901／ADM细胞，并比较转染效率，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2、SGC7901／ADM细胞株均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；pcDNA3.1-EGFP质粒由贵州省医学分子生物学重点实验室周建奖教授惠赠。LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，电穿孔仪（美国Bio-rad Gene Pulser Xcell真核系统），Bio-rad 0.4cm电转杯，电转buffer（自配含10mmol／L HEPES，150mmol／L NaCl，5mmol／L CaCl2，6mmol／L葡萄糖pH 7.2的缓冲液）；Ezgene EndoFree Plasmid ezFlow Miniprep Kit购自Biomga公司；DMEM、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，细胞培养器皿购自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HepG2细胞培养液成分为高糖 DMEM（含10%FBS，1%双抗）。SGC7901／ADM细胞培养液成分为RPMI 1640（含10%FBS，1%双抗），在细胞培养瓶中培养，每天换液，2～3d传代1次。

1.2.2 细胞转染 （1）脂质体转染法：完全培养基培养HepG2、SGC7901／ADM细胞，转染时取传代3次的对数生长期细胞，以5×104个细胞接种至6孔板，每孔设2个复孔，加入1mL无抗性培养基，细胞贴壁密度为50%～80%时即可进行转染。将eGFP质粒用相应脂质体LipofetamineTM2000转染细胞（详细步骤参见LipofetamineTM2000产品说明书）。（2）电穿孔转染法：传代3次的细胞长满70%～80%时可用于转染，PBS冲洗3次，0.25%胰酶消化60s，完全培养基终止消化。收集细胞悬液后1 000r／min离心8min，弃上清液，用无血清培养液洗涤1次，离心后弃上清液，用电转buffer重悬2次，以电转buffer重悬细胞至1×107个／mL。取1×106个细胞悬液和pcDNA3.1-EGFP质粒10μg分装入0.4cm电转杯中，小心混匀后4℃静置10min，以1个电脉冲、脉冲时间20 ms、电压270V方波电转。电转后培养于12孔板，电转后转移至37℃、含15%FBS的培养基培养，每孔设两个复孔。

1.2.3 细胞存活率测定 两种转染实验中均设置未转染的细胞为阴性对照，且各组细胞数量保持一致，完成转染后培养8 h，胰蛋白酶消化各组细胞，以流式分析细胞计数，各转染组细胞数与阴性对照细胞数的比值即转染8h的细胞存活率。

1.2.4 转染效率测定 电转染后培养48h，借助绿色荧光标志蛋白eGFP判断转染效率。用PBS洗涤贴壁细胞3遍后置显微镜下观察，由于eGFP为绿色荧光，显微参数为480nm激发波长，520nm发射波长。每孔共计5个高倍镜视野观察计算绿色荧光细胞数。转染效率（%）＝绿色荧光细胞数／总细胞数×100%，取5个视野平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞存活率 重复3次以上实验，脂质体法转染HepG2细胞存活率为（65.7±1.8）%，电穿孔法 HepG2细胞存活率为（38.5±2.4）%，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。脂质体法转染SGC7901／ADM 细胞存活率为（60.6±1.4）%，电穿孔法SGC7901／ADM 细胞存活率为（37.2±1.6）%，二者比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 细胞转染率 重复3次以上实验，利用脂质体转染eGFP质粒至HepG2细胞所获得的阳性转染率为（20.8±2.1）%，而电穿孔法转染效率增高至（49.6±2.5）%，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。利用脂质体转染eGFP质粒至SGC7901／ADM 细胞所获得的阳性转染率为（25.4±1.3）%，而电穿孔法转染效率增高至（52.6±2.1）%，二者比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

脂质体法是通过脂质双分子层所构成的囊状载体包裹外源基因与细胞膜融合内吞而完成外源基因的导入，该方法操作简便、细胞毒性低，但对细胞具有选择性，转染效率受细胞类型影响。电穿孔法是利用高强度的电场瞬时改变细胞膜的状态和通透性，从而吸收周围介质中的外源分子进入细胞，具有简单易行、可重复性强、安全性高、适用性广等优点[2]，但伴随较高的细胞毒性。

本研究选取较大分子带GFP绿色荧光蛋白的质粒eGFP为转染物，以常用的阳离子脂质体LipofectamineTM2000和电穿孔两种方法分别转染HepG2、SGC7901／ADM细胞。脂质体表面带正电荷，与核酸中带负电荷的磷酸根相互吸附形成脂质体核酸复合物，该复合物能与细胞膜表面负电荷相互吸附，通过胞饮作用进入细胞内[7-8]。利用脂质体法转染eGFP质粒的转染效率为（20.8±2.1）%，这与朱晓莹等[9]的结果相符，用于转染时，脂质体虽具有良好的膜亲和性，但缺点在于其细胞毒性和低转染效率性[10]。电穿孔法是利用外加电场产生一定的电脉冲，诱导活细胞产生跨膜电位，由于外加电场强度大于细胞膜穿孔的临界值，引起细胞质膜结构暂时性改变，导致细胞膜形成可恢复的孔隙，细胞膜产生小孔，从而使外源基因进入细胞内。相较脂质体转染技术，电转技术因较大的电压刺激使得电转后细胞的死亡率较高。有研究发现，细胞存活率在50%左右时的电场参数可获得最佳的转染效率[11]。本研究结果显示，脂质体法转染时细胞存活率较高，电穿孔转染时细胞存活率虽然偏低，但是电穿孔法转染可使上述两种细胞的转染效率均提高至50%左右，提示使用电穿孔法能明显改善大片段载体低转染效率的情况，这与江雪等[12]的观点一致。

综上所述，脂质体LipofectamineTM2000更容易包裹吞入片段较小的转染物，电穿孔法操作简单，能将DNA、RNA、抗体、酶等物质转入细菌、动物细胞、植物细胞等，改善大片段载体低转染效率的情况，更适合用于常规环状质粒转染构建工程细胞。

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