脂肪酶催化共轭亚油酸植物甾醇酯合成工艺的优化

刘振春，孙慧娟，耿存花，韩 宇

(吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

植物甾醇是广泛存在于植物中的一种活性物质，主要以醇结构和酯化形式存在于自然界中,其中含量较丰富的有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇[1-2]。植物甾醇的化学结构类似动物体内的胆固醇，其可以降低血液中的总胆固醇含量，减轻心血管疾病的发生[3]，现已被大量应用在医药品(AD、ADD的前体[4])、保健品(作为抗氧化、抗癌物质添加在食品中[5])、化妆品和饲料等领域，具有抗炎、退热、降胆固醇、美容和促进动物生长等作用[6]。

但是游离型的植物甾醇油溶性差并且具有弱疏水性，在人体内的溶解性和生物利用率较低[7]。酯化型的植物甾醇油溶性和溶解性均较好，在人体中的吸收利用率较游离型植物甾醇提高约5倍，可以应用于食品涂抹、色拉调料、营养添加剂和饮料乳制品中[8-9]。目前，国内外在该领域的研究以油酸、亚麻酸等脂肪酸为主，对共轭不饱和脂肪酸的研究较少。共轭亚油酸是一种多不饱和脂肪酸，具有提高免疫、抗动脉粥样硬化、降血脂的功效[10-11]。为此，本研究利用脂肪酶催化植物甾醇和共轭亚油酸进行酯化反应生产共轭亚油酸植物甾醇酯，并对其合成工艺进行优化，以提高甾醇在人体内的吸收利用率，进而为甾醇酯的安全、高效合成提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物甾醇(其中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇总含量为950 g/kg)，西安蓝天生物工程有限公司；共轭亚油酸(CLA)，青岛澳海生物有限公司；脂肪酶Pseudomonas，苏州奥维科生物科技有限公司；环己酮，分析纯；正己烷，色谱纯。

1.2 仪器与设备

JJ-精密增力电动搅拌器，金坛市科析仪器有限公司；QP气相色谱质谱联用仪，日本岛津公司；高纯氮气发生器，北京汇佳精仪公司；HH-2数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 共轭亚油酸植物甾醇酯的制备 采用脂肪酶Pseudomonas催化植物甾醇与共轭亚油酸直接酯化的方法合成共轭亚油酸甾醇酯，以水作为反应溶剂。在连接有电动搅拌器、温度计、油水分离器的三口烧瓶中，加入一定量的甾醇、共轭亚油酸、脂肪酶，充入自制的氮气，水浴加热；反应物加热后呈黏稠状液体，用电动搅拌器不断搅拌进行酯化反应，恒温控制，待反应结束后，将产物放入离心管中进行离心，取上层油状物，冷却至室温，即得到甾醇酯粗品。

1.3.2 甾醇酯的纯化 将得到的甾醇酯粗品，先用NaHCO3洗涤3次，再用乙醇进行洗涤；去除过量的共轭亚油酸和游离的植物甾醇，而后与环己酮混匀后加入到烧瓶中，加热至完全溶解后，停止加热；自然冷却至25 ℃结晶，进行抽滤，滤饼经真空干燥至恒质量，再经过3次重结晶，精制后的甾醇酯纯度可达到90%以上[12]。

1.3.3 甾醇酯的气相色谱分析及酯化率的计算 将纯化后的甾醇酯样品用正己烷稀释一定倍数后进行气相色谱分析[13]。条件如下：MXT-1型石英毛细管色谱柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)，FID检测器；进样量为1.0 μL，进样口温度380 ℃，载气为高纯N2，恒压模式；分流比为10∶1，H2流速为50 mL/min，柱流速为1 mL/min，尾吹气N2，流速30 mL/min。程序升温：初温300 ℃，以3 ℃/min升至330 ℃，再以2 ℃/min的速度升至350 ℃，保持1 min。

根据图谱中各组分的峰面积计算共轭亚油酸甾醇酯的酯化率，公式为：

式中：A为植物甾醇的总峰面积，B为植物甾醇酯的峰面积，1.647为植物甾醇与植物甾醇共轭亚油酸酯的转换系数。

1.3.4 共轭亚油酸甾醇酯酯化条件的单因素试验 本试验主要研究反应温度、反应时间、物料比(共轭亚油酸与植物甾醇物质的量比)、酶添加量4个单因素对共轭亚油酸甾醇酯酯化率的影响。

(1)反应温度。在物料比为3∶1、酶添加量为6%、反应时间为40 h的条件下，考察反应温度(35，45，55，65和75 ℃)对酯化率的影响，确定最佳反应温度。

(2)反应时间。在反应温度为55 ℃、物料比为3∶1、酶添加量为6%的条件下，考察反应时间(30，35，40，45和50 h)对酯化率的影响，确定最佳反应时间。

(3)物料比。在反应温度为55 ℃、酶添加量为6%、反应时间为40 h的条件下，考察物料比(1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和5∶1)对酯化率的影响，确定最佳物料比。

(4)酶添加量。在反应温度为55 ℃、物料比为3∶1、反应时间为40 h的条件下，考察酶添加量(2%，4%，6%，8%和10%)对酯化率的影响，确定最佳的酶添加量。

1.3.5 Box-Behnken响应面设计试验 根据单因素试验结果，采用响应面法进行试验数据处理，选用Box-Behnken模型对共轭亚油酸甾醇酯合成的影响因素进行响应面设计，以酯化率为响应值进行优化，试验因素和水平见表1。

表1 共轭亚油酸甾醇酯合成条件响应面试验的因素和水平

1.3.6 最佳工艺条件的确定及论证 根据响应面试验确定共轭亚油酸甾醇酯合成的最佳工艺条件，并进行试验验证。

2 结果与分析

2.1 共轭亚油酸甾醇酯合成条件的单因素试验

2.1.1 反应温度 从图1可以看出，反应温度对酯化率有显著的影响，随着反应温度的升高酯化率迅速增加，到55 ℃时达到最高点，之后随着反应温度的继续升高，酯化率有所下降，这可能是由于温度过高导致部分酶失活，酶活力下降而不利于酯化反应进行所致。另外，高温还会使产品颜色变深，导致甾醇易发生脱水反应，从而影响产品质量。综上考虑，反应温度选为55 ℃[14]。

图1 反应温度对酯化率的影响

2.1.2 反应时间 由图2可见，随着反应时间的延长酯化率逐渐增大，反应前40 h酯化率提高较快，反应超过40 h后酯化率增加缓慢，反应逐渐趋于稳定。反应时间过长可能会增加副反应发生的几率，故最佳反应时间选为40 h。

2.1.3 物料比 由图3可知，随着共轭亚油酸添加比例变大，酯化率呈先增大后变小的变化趋势。当物料比即共轭亚油酸与植物甾醇的物质的量比达到3∶1时，酯化率达到最大值，继续增大物料比酯化率开始降低。这是因为过多的酸可以充当反应溶剂，增大与甾醇的接触面积，使反应更加充分，但过多的底物会相对减小酶的浓度，降低酶的催化能力，故3∶1为最佳物料比。

图3 物料比对酯化率的影响

2.1.4 酶添加量 从图4可以看出，酶对酯化反应的催化作用十分明显，随着酶添加量的增大，酯化率迅速增加。当酶添加量超过6%时，酯化率呈下降趋势，这是因为酶用量太大会使酶发生聚集而不能与底物充分接触，从而降低了酶的催化能力[15]。另外考虑到经济因素，故选择6%作为酶的最佳添加量。

2.2 共轭亚油酸甾醇酯合成的响应曲面设计试验

2.2.1 试验结果与分析 选择对酯化率影响较大的因素，即反应温度、反应时间、酶添加量进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验设计，试验结果见表2。

表2 共轭亚油酸甾醇酯合成的Box-Behnken 试验结果

利用软件Design-Expert 7.0.0对表2数据进行多元回归拟合，得到酯化率(Y)对以上三因素的二次多元回归模型为：

对该回归方程进行方差分析，结果如表3所示。

表3 共轭亚油酸甾醇酯合成工艺酯化率回归方程的方差分析

2.2.2 反应温度和酶添加量的交互作用 当反应时间为40 h，物料比为3∶1时，根据回归模型绘制反应温度和酶添加量对酯化率影响的等高线和响应面见图5。从图5可以看出，在反应温度为50～60 ℃时，酯化率呈现先增大后减少的趋势，在55 ℃左右达到最高点；在酶添加量为4%～7%时，酯化率升高明显，而在酶添加量为7%～8%时酯化率缓慢降低，说明酶添加量对酯化率的影响作用大于反应温度，在响应面图上表现为坡度更为陡峭。从等高线图上看，等高线为椭圆形，说明反应温度和酶添加量的交互作用对酯化率有显著影响。

图5 反应温度和酶添加量交互作用对酯化率的影响

2.2.3 反应温度和反应时间的交互作用 当酶添加量为6%，物料比为3∶1时，根据回归模型绘制反应温度和反应时间对酯化率影响的等高线和响应面如图6所示。由图6可知，在反应温度为50～60 ℃、反应时间为35～45 h时，酯化率呈现先逐渐升高后又持续降低的变化过程。从等高线图上看，等高线为椭圆，说明反应温度和反应时间的交互作用对酯化率有显著影响，在反应时间40～42 h以及反应温度为55～57.5 ℃的交叉区域内酯化率达到最高。反应温度和反应时间在响应面上的变化趋势无明显差异，说明二者对酯化率均有较大影响。

图6 反应温度和反应时间交互作用对酯化率的影响

2.2.4 酶添加量和反应时间的交互作用 当反应温度为55 ℃时，物料比为3∶1时，根据回归模型绘制反应时间和酶添加量对酯化率影响的等高线和响应面见图7。由图7可以看出，等高线接近于圆形，可知酶添加量与反应时间的交互作用对酯化率影响不显著。由响应面图中的变化趋势可知，酶添加量对酯化反应的影响较反应时间大。

2.2.5 最优工艺条件的确定及其验证试验 通过对回归方程的计算与分析，最终确定的共轭亚油酸甾醇酯合成的最佳工艺条件为：反应温度55.63 ℃、酶添加量6.58%、反应时间41.15 h。考虑到具体操作和因素水平的控制，最后修正为反应温度55.5 ℃、反应时间41.2 h、酶添加量6.6%。在此条件下进行3个重复的验证试验，以检验脂肪酶催化合成共轭亚油酸植物甾醇酯的酯化率预测模型方程的有效性和拟合性。结果表明，酯化率的试验值(84.37%)与模型预测值(84.48%)相差0.11%，表明该预测模型可以较好地反应甾醇酯的合成条件。

图7 反应时间和酶添加量交互作用对酯化率的影响

2.3 植物甾醇和共轭亚油酸植物甾醇酯的气相色谱分析

由图8、9可以看出，共轭亚油酸植物甾醇酯出峰时间较植物甾醇早，酯化反应基本完全，甾醇酯与植物甾醇有较好的分离，说明共轭亚油酸植物甾醇酯粗品经过重结晶后，产物纯度较高。

图8 植物甾醇的气相色谱图

3 结 论

本试验利用脂肪酶Pseudomonas催化共轭亚油酸植物甾醇酯的合成，在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken试验设计对合成工艺进行了优化，建立了拟合性良好的回归模型方程，并对主要因素及其相互间的交互作用进行了分析，经过修正得到脂肪酶催化合成共轭亚油酸甾醇酯的最优工艺参数为：反应温度55.5 ℃、酶添加量6.6%、反应时间41.2 h，在此条件下，验证试验得到的酯化率为 84.37%，与其他的文献[16-18]相比，该方法反应时间短、酯化率高，为甾醇类衍生物的合成提供了一定的借鉴。

[参考文献]

[1] Berger A,Jones P J H.Plant sterols:Factors affecting the irefficacy and safety as functional food ingredients [J].Lipids Health,2004,3:5-23.

[2] Kritchev S D,Chen S C.Phytosterol-health benefits and potential concerns:A review [J].Nutr Res,2005,25:413-428.

[3] 许新德,邵 斌.植物甾醇酯：一种新型的降胆固醇健康食品 [J].中国油脂,2004,29(8):25-28.

Xu X D,Shao B.Phytosterol esters:A novel functional food with cholesterol-lowering [J].China Oils and Fats,2004,29(8):25-28.(in Chinese)

[4] Wang Z L,Zhao F S,Chen D J,et al.Transformation of phytosterol to produce androsta-diene-dione by resting cells of mycobactenum in cloud point system [J].Process Biochemistry,2006,41:557-561.

[5] Bradford P G,Awad A B.Phytosterols as anticancer compoun-ds [J].Molecular Nutrition & Food Research,2007,51:161-170.

[6] Elke A T,Guus S M J,Duchateau E,et al.Proposed mechanisms of cholsterol-lowering action of plant sterols [J].European Journal of Lipid Science and Technology,2003,105:171-185.

[7] Hicks K B,Moreau R A.Phytosterols and phytostanols:Functional food cholesterol busters [J].Food Technology,2001,55(1):63-67.

[8] 赵国志,刘喜亮,刘智峰.植物甾醇及其产品开发利用(下) [J].粮食与油脂,2006(3):3-8.

Zhao G Z,Liu X L,Liu Z F.Utilization and development of phytosterol(Ⅱ) [J].Cereals & Oils,2006(3):3-8.(in Chinese)

[9] 王稳航.植物甾醇及其在食品中的应用 [J].西部粮油科技,2002(6):41-44.

Wang W H.Phytosterol and it’s application in food [J].China Western Cereals & Oils Technology,2002(6):41-44.(in Chinese)

[10] 龚晨睿,马 良,田 辉.共轭亚油酸对大鼠血脂水平的调节作用及其机理的研究 [J].中国比较医学杂志,2003,13(4):204-206.

Gong C R,Ma L,Tian H.Effect of conjugated linoleic acids on serum lipids level in rats [J].Chinese Journal of Laboratory Animal Science,2003,13(4):204-206.(in Chinese)

[11] 李春荣,王三永,谢志桥.植物甾醇共轭亚油酸的制备及其血脂调节作用的研究 [J].中国食品添加剂,2007(3):69-72.

Li C R,Wang S Y,Xie Z Q.Preparation and investigation on blood lipidsof phytosterol esters of CLA [J].China Food Additives,2007(3):69-72.(in Chinese)

[12] 许文林,王雅琼,黄一波,等.重结晶法精制植物甾醇的溶剂选择 [J].扬州大学学报:自然科学版,2002,5(1):58-62.

Xu W L,Wang Y Q,Huang Y B,et al.Studies on the selection of solvents for the recrystallization and purification of phytosterol [J].Journal of Yangzhou Univensity:Nataral Science Edition,2002,5(1):58-62.(in Chinese)

[13] 庞 敏，姜绍通，冯瑞彩.Novozym435 酶促催化合成共轭亚油酸植物甾醇酯 [J].油脂化学,2011,36(5):8-11.

Pang M,Jiang S T,Feng R C.Novozym435 catalyzed synthesis of conjugated linoleic acid phytosterol ester [J].China Oils and Fats,2011,36(5):8-11.(in Chinese)

[14] 盛 漪,华 伟,谷文英.植物甾醇生理功能及其研究进展 [J].西部粮油科技,2003(2):32-35.

Sheng Y,Hua W,Gu W Y.Research about the funciton of phytosterols [J].China Western Cereals & Oils Technology,2003(2):32-35.(in Chinese)

[15] Kim B H,Akoh C C.Modeling and optimization of lipase-catalyzed synthesis of phytosteryl esters of oleic acid by response surface methodology [J].Food Chemistry,2007,102(1):336-342.

[16] 陈茂彬，黄 琴，吴谋成.植物甾醇油酸酯产品的合成工艺研究 [J].中国油脂,2005,30(6):63-65.

Chen M B,Huang Q,Wu M C.Study on the synthesis technology of phytosterol oleate [J].China Oils and Fats,2005,30(6):63-65.(in Chinese)

[17] Nikolaus W.Fatty acid stery,stanyl,and steroids esters by esterification and transesterification in vacuo using Candida rugosa as catalyst [J].Agric Food Chem,2001,49:67-71.

[18] Pouilloux Y,Courtois G,Boisseau M.Solid base catalysts for the synthesis of phytosterol esters [J].Green Chemistry,2003,5:89-91.