山荆子中根皮苷和黄酮含量的测定及其乙醇提取物的抗氧化活性

丁传波，赵 婷，董 岭，陈大勇，李慧萍,高 畅，李 伟，郑毅男，刘文丛

(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118)

山荆子[Malusbaccata(Linn.)Borkh.]，别名山丁子、林荆子、山定子等，是蔷薇科(Rosaceae) 苹果属(Malus)多年生木本植物，主要分布于我国东北、华北及西南等地，朝鲜及俄罗斯西伯利亚地区也有分布[1]。目前，针对山荆子的研究主要集中在其绿化观赏及抗旱作用等方面[2-3]，对于其化学成分的研究少有报道。李伟[4]研究表明，山荆子花和叶中的挥发油包括萜类、酯类和烯烃类化合物等，主要成分是法呢烯。山荆子叶中主要活性成分是黄酮类和多酚类化合物，其中根皮苷是其药理活性成分之一[5-6]。根皮苷是一种广泛分布于苹果果实、树皮和叶以及多穗柯甜茶嫩叶中的多酚类化合物，具有抗氧化[7]、调节血糖[8]、清除自由基[9-10]等多种药理活性。目前，对于山荆子叶中根皮苷的研究仅见少数文献报道[6]，茎皮及果中的根皮苷含量尚未见报道。本试验测定了同时期山荆子鲜叶、茎皮和果实中根皮苷的含量及其阴干叶和果实中的黄酮含量，并比较了山荆子阴干叶和果实乙醇提取物的抗氧化活性，以期为山荆子的品质评价及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 山荆子鲜叶、青果及茎皮均于06-02在同株采收，于吉林农业大学校园内不同的地点采取3批样品，经吉林农业大学中药材学院郑毅男教授鉴定为蔷薇科(Rosaceae) 苹果属(Malus)山荆子。

1.1.2 仪器与试剂 LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津，SPD-20A紫外检测器)，超声波清洗器(KQ-250DB，昆山超声仪器有限公司)，BP211D电子天平(德国Sartorious公司)，SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)，UV-2450紫外分光光度计(日本SHI-MADZU公司)等。根皮苷对照品(批号：K111228)购于西安开来生物工程有限公司，VC、2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购于Sigma公司，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、亚油酸购于西亚试剂公司，芦丁对照品纯度为98.6%(实验室自制)，乙腈(色谱纯)购于美国Fisher公司，纯水为杭州娃哈哈有限公司生产。其余试剂均为分析纯试剂。

1.2 方 法

1.2.1 山荆子鲜叶、茎皮、果实中根皮苷含量的测定 (1)根皮苷标准曲线的制作。精密称取根皮苷对照品10.00 mg，置于100 mL容量瓶中用甲醇溶解后定容，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即可制得质量浓度为0.10 mg/mL的根皮苷对照品溶液。

取上述制备的根皮苷对照品溶液0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL，分别定容到1 mL离心管中，摇匀后进行HPLC检测。用外标法计算峰面积，以质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，建立标准曲线，求回归方程，用于测定山荆子鲜叶、茎皮、果实中的根皮苷含量。

(2) 山荆子鲜叶、茎皮、果实中根皮苷含量的测定。精密称取新鲜的山荆子叶1.006 0 g，茎皮 1.002 5 g，青果0.995 5 g，剪碎后各自放入规格相同的250 mL锥形瓶中，分别加入50 mL甲醇， 于40 ℃在40 Hz、250 W超声波作用条件下提取30 min，提取2次，合并2次提取液，过滤后定容至100 mL容量瓶中，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得山荆子鲜叶、茎皮和果实的甲醇提取物。对样品进行HPLC检测，以甲醇为对照，计算根皮苷含量。

(3) HPLC条件。色谱柱：大连依利特HypersilODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流动相：乙腈-水(V(乙腈)∶V(水)=25∶75)；流速：1.0 mL/min；检测波长：285 nm；进样量：20 μL。

1.2.2 阴干山荆子叶、果实中黄酮含量的测定 (1)芦丁标准曲线的制作。精确称取芦丁对照品(105 ℃干燥至恒定质量)10.00 mg于100 mL容量瓶中，加60.00 mL体积分数75%的乙醇溶解之后再定容至100 mL，配制成质量浓度为0.10 mg/mL的芦丁溶液。将芦丁溶液用体积分数75%的乙醇配制成质量浓度分别为0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL的标准溶液，备用。

准确吸取不同质量浓度的芦丁标准溶液1.00 mL，置于10 mL具塞试管中，加入质量分数5%的NaNO2溶液0.30 mL，摇匀，放置6 min后加入质量分数10%Al(NO3)3溶液0.30 mL，摇匀，放置6 min 后加入质量分数4%NaOH溶液4.00 mL，摇匀，用体积分数75%乙醇定容，15 min后于510 nm下测定吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标(X轴)、吸光度为纵坐标(Y轴)绘制标准曲线，求回归方程，用于测定阴干的山荆子叶和果实中的黄酮含量。

(2) 阴干山荆子叶、果实中黄酮含量的测定。分别称取70 g阴干后的山荆子叶和果，粉碎，按料(g)液(mL)比1∶25分别加入体积分数75%的乙醇， 于40 ℃在40 Hz、250 W超声波作用条件下提取30 min，提取3次，合并3次提取液。减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥即得山荆子叶和果实乙醇提取物。测定样品在510 nm下的吸光度，计算黄酮含量。

1.2.3 山荆子阴干叶和果实乙醇提取物的抗氧化活性测定 抗氧化活性测定参照文献[11-12]的方法并略有改动。(1) 清除DPPH自由基活性的测定。将山荆子阴干叶和果实乙醇提取物及VC(阳性对照)配制成不同质量浓度(0.012 5，0.125，1.25，2.50和5.00 mg/mL)的溶液。将DPPH用无水乙醇配制成2×10-4mol/L的溶液。取2.00 mL样品溶液，加入7.50 mL DPPH溶液，振荡，摇匀，室温下反应1 h，在517 nm下测定其吸光度，以体积分数75%的乙醇为空白对照。自由基清除率=(As-Ai)/As×100%。式中：As表示空白对照在517 nm的吸光度，Ai表示样品在517 nm的吸光度。试验重复3次，取平均值作图。

(2) 清除ABTS自由基活性的测定。 用去离子水配制7 mmol/L的ABTS溶液及2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液。取过硫酸钾溶液5.00 mL，加入到15.00 mL ABTS溶液中，在室温下置于黑暗处反应16 h，形成ABTS 自由基储备液。用体积分数75%乙醇对ABTS自由基储备液进行稀释，使其在734 nm下的吸光度为0.70±0.05，备用。准确吸取0.80 mL不同质量浓度(0.019，0.19，1.90，3.85，7.70 mg/mL)的样品溶液及BHT溶液(阳性对照)，加入7 mL 稀释的ABTS液，振荡混匀，在室温下反应30 min，于734 nm下测定其吸光度，以体积分数75%的乙醇为空白对照。试验重复3次，取平均值作图。

ABTS自由基清除率=(A2-A1)/A2×100%。

式中：A1为样品在734 nm下的吸光度，A2为空白对照在734 nm下的吸光度。

(3)还原力测定。将山荆子阴干叶、果实乙醇提取物以及阳性对照BHT配制成不同质量浓度的溶液(0.019，0.19，1.90，3.85，7.70 mg/mL)。取各质量浓度的溶液0.20 mL，加入2.50 mL的磷酸盐缓冲液(0.20 mol/L，pH 6.6)和2.50 mL 质量分数1%的铁氰化钾，剧烈振荡，混匀后50 ℃下水浴20 min。然后向体系中加入2.50 mL质量分数10%的三氯乙酸。混匀后在4 200 r/min下离心10 min，取上清液2.00 mL于10 mL试管中，加入2.50 mL蒸馏水和0.50 mL质量分数 0.10%的三氯化铁，10 min后于700 nm下测定其吸光度。吸光度越高表明还原力越强。试验重复3次，取平均值作图。

2 结果与分析

2.1 山荆子中鲜叶、茎皮、果实中根皮苷含量的测定

经分析，根皮苷标准品峰面积(Y)与其质量浓度(X)的回归方程为：Y=2.000×105X+1.874 6×104，R2=0.996 2(n=5)，在20.00～100.00 μg/mL范围内根皮苷质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。

山荆子中鲜叶、茎皮、果实样品的HPLC结果见图1。从图1可以看出，在本试验的HPLC条件下，山荆子鲜叶、茎皮和果实中的根皮苷HPLC峰能与其他物质的HPLC峰完全分开，说明本试验设置的条件，适用于山荆子鲜叶、茎皮和果实中根皮苷的含量测定。经测算，山荆子鲜叶、茎皮和果实中根皮苷的含量分别为(12.00±3.60)，(21.60±6.10)和(1.18±0.15) mg/g。可见根皮苷在茎皮中的含量最高，其次是叶，在果实中含量最低，其茎皮中根皮苷的含量是叶的1.80倍，是果实的17倍。

2.2 山荆子阴干叶和果实中黄酮含量的测定

芦丁质量浓度(X)与510 nm下吸光度(Y)的回归方程为：Y=12.993X-6×10-4，R2=0.998 6。在0～0.05 mg/mL内，芦丁的质量浓度与其吸光度呈良好的线性关系。

经测算，山荆子阴干叶中黄酮含量((4.78±0.62) mg/g)约是果实((0.68±0.04) mg/g)中的7倍。

2.3 阴干山荆子叶和果实乙醇提取物对DPPH自由基的清除活性

DPPH是一种在常温下很稳定的自由基，因此常被用来评价化合物的抗氧化活性。从图2可以看出，山荆子阴干叶和果实乙醇提取物对DPPH自由基具有较强的清除效果，当山荆子叶和果实乙醇提取物的质量浓度为0.012 5 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率分别为57.50%和14.50%，显然山荆子叶乙醇提取物对DPPH自由基的半数清除率(IC50)<0.012 5 mg/mL，较果实乙醇提取物清除DPPH自由基的能力强。在相同的质量浓度(0.012 5 mg/mL)下，天然抗氧化剂VC对DPPH自由基的清除率为86.70%。随着质量浓度的增加，山荆子阴干叶和果实乙醇提取物样品对DPPH自由基的清除率逐渐增大，而VC的清除率变化不大。各样品清除DPPH自由基的能力从小到大依次为：山荆子果实乙醇提取物<山荆子叶乙醇提取物

2.4 阴干山荆子叶和果实乙醇提取物对ABTS自由基的清除活性

图3显示，随着样品质量浓度的增加，阴干山荆子叶和果实乙醇提取物及BHT对ABTS自由基的清除率不断增大，当BHT的质量浓度增加到0.19 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除率为92.4%，之后趋于稳定，表明ABTS自由基基本被清除。而在此质量浓度下，山荆子阴干叶和果实乙醇提取物对ABTS自由基的清除率分别为66.5%和47.0%，可见叶乙醇提取物的IC50<0.19 mg/mL，果实乙醇提取物的IC50接近于0.19 mg/mL。表明山荆子叶和果实乙醇提取物具有较强的抗氧化活性。

图2 山荆子阴干叶和果实乙醇提取物对DPPH自由基的清除活性

图3 山荆子阴干叶和果实乙醇提取物对ABTS自由基的清除活性

2.5 阴干山荆子叶和果实乙醇提取物的还原力

抗氧化剂能够通过自身的还原作用给出电子，使自由基变成稳定的分子，从而失去活性,还原力越大，其抗氧化活性就越强，因此可通过还原力的大小来判断物质抗氧化活性的强弱。由图4可知，当样品和BHT的质量浓度为0.019 mg/mL时， BHT、山荆子阴干叶和果实乙醇提取物在700 nm下的吸光度分别为0.076，0.061和0.079，但随着质量浓度的不断增大，三者的还原力差距逐渐加大。在0.019～7.7 mg/mL的质量浓度内，山荆子阴干叶和果实的还原力与其质量浓度呈现量效关系，即随着质量浓度的增大而增强，且山荆子叶的还原力较果实强，但均较BHT弱。

图4 山荆子阴干叶和果实乙醇提取物的还原力比较

3 讨 论

本研究采用超声波辅助提取山荆子茎皮、叶和果实中的根皮苷，这种方法较传统的热回流提取操作简单、提取时间短；采用乙腈-水为流动相的方法与文献[13]有所不同，但能够较好地将根皮苷分离出来，且峰形较好。

黄酮是一类复杂的化合物，具有多种药理活性，可以提高抗氧化酶水平、清除自由基、保护机体因自由基过多而产生的损伤[14-15]。山荆子叶和果实中含有较多的黄酮类化合物，但对于其黄酮含量及活性研究较少，仅有少数研究报道了其抗肥胖活性[16]。本试验通过亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠方法测定了山荆子叶和果实中的黄酮含量，并就山荆子叶和果实乙醇提取物对DPPH、ABTS自由基的清除能力和还原能力进行了测定，结果显示，山荆子叶和果实乙醇提取物均具有较强的抗氧化活性和还原力，这可能与其含有较多的黄酮类物质有关，但其具体机制还有待进一步研究。本研究结果显示，山荆子中根皮苷含量茎皮>叶>果实，这与李荣涛等[17]的研究结果一致。

4 结 论

本研究采用超声波辅助提取结合HPLC法，测出山荆子鲜茎皮、叶和果实中的根皮苷含量分别为(21.60±6.10)，(12.00±3.60)，(1.18±0.15) mg/g；本研究还测定了阴干山荆子叶和果实中的黄酮含量，结果表明，阴干的山荆子叶乙醇提取物中黄酮含量约为果实的7倍。结果显示，山荆子是一种天然的抗氧化剂，具有广阔的开发和利用前景。

[参考文献]

[1] 李育农.苹果属植物种质资源研究 [M].北京:中国农业出版社,2001:67.

Li Y N.Researches of germplasm resources ofMalusMill [M].Beijing:China Agriculture Press,2001:67.(in Chinese)

[2] 马树华.四种北方阔叶树苗木对汽车尾气污染的生理反应与抗性评价 [D].哈尔滨:东北林业大学,2004.

Ma S H.The physiologlcal and biochemcial response of seedings of four northern deciduous trees to automobile exhaust and tolerance evaluating [D].Harbin:Northeast Forest University,2004.(in Chinese)

[3] 孙志虎，王庆成.应用PV技术对北方4种阔叶树抗旱性的研究 [J].林业科技,2003,39(2):33-38.

Sun Z H,Wang Q C.The drought resistance of four broad-leaved species in the North of China with PV technique [J].Scientia Silvae Sinicae,2003,39(2):33-38.(in Chinese)

[4] 李 伟.顶空固相微萃取-气相色谱质谱法分析山荆子花和叶中的挥发性成分 [J].天然产物研究与开发.2012,24(4):490-493.

Li W.HS-SPME-GC-MS analysis of volatile constituents from the flowers and leaves ofMalusbaccata(Linn.) Borkh [J].Nat Prod Res Dev,2012,24(4):490-493.(in Chinese)

[5] 聂继云，吕德国，李 静，等.22 种苹果种质资源果实类黄酮分析 [J].中国农业科技,2010,43(21):4455-4462.

Nie J Y,Lü D G,Li J,et al.A preliminary study on the flavonoids in fruits of 22 apple germplasm resources [J].Scientia Agricultura Sinica,2010,43(21):4455-4462.(in Chinese)

[6] 李 萍.苹果属植物叶片类黄酮的含量及多样性研究 [D].北京:中国农业科学院,2010.

Li P.The study on contents and diversity of flavonoids in leaves ofMalusspecies [D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2010.(in Chinese)

[7] 张泽生,胡 莎，邵 婵,等.根皮苷对由高脂导致果蝇氧化损伤的保护作用 [J].食品科技,2012,37(4):195-198.

Zhang Z S,Hu S,Shao C,et al.Protective effect of phloridzin on the fat-induced oxidative damage in drosophila melanogaster [J].Food Science and Technology,2012,37(4):195-198.(in Chinese)

[8] Dudash J,Zhang X,Zeck R,et al.Glycosylated dihyd rocha lcones as potent and selective sodium glucofle co-transporter 2 (SGLT2) inhibitors [J].Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,2004,14:5121.

[9] Rezk B M,Haenen G R,Bast A,et al.The antioxidant activity of phloretin:The disclosure of a new antioxidant pharmacophore in flavonoids [J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,295:9-13.

[10] Vasantha Rupasinghe H P,Yasmin Afsana.Inhibition of oxidation of aqueous emulsions of omega-3 fatty acids and fish oil by phloretin and phloridzin [J].Molecules,2010,15:251-257.

[11] He J S,Huang B,Ban X Q,et al.Invitroandinvivoantioxidant activity of the ethanolic extract fromMeconopsisquintuplinervia[J].Journal of Ethnopharmacology,2012,141:104-110.

[12] Huang B,Ke H B,He J S,et al.Extracts ofHaleniaellipticaexhibit antioxidant propertiesinvitroandinvivo[J].Food and Chemical Toxicology,2011,49:185-190.

[13] 李胜华，伍贤进，牛友芽，等.HPLC 法测定多穗柯叶中根皮苷含量 [J].食品工业科技,2009,30(8):327-331.

Li S H,Wu X J,Niu Y Y,et al.Detemintation of phloridzin inLithocarpuspolystarchRehd by HPLC method [J].Science and Technology of Food Industry,2009,30(8):327-331.(in Chinese)

[14] Tachakittirungrod S,Okonogi S,Chowwanapoonpohn S.Study on antioxidant activity of certain plants in Thailand:Mechanism of antioxidant action of guava leaf extract [J].Food Chemistry,2007,103:381-388.

[15] Terao J.Dietary flavonoids as antioxidants [J].Forum of Nutrition,2009,61:87-94.

[16] Wei X，Zhao R，Sun Y H，et al．The leaf extract of Siberian Crabapple (Malusbaccata(Linn.) Borkh) contains potential fatty acid synthase inhibitors [J].Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry,2009,24:234-340.

[17] 李荣涛，刘杰超，焦中高.RP-HPLC测定苹果树枝、叶中根皮苷的含量 [J].食品工业科技,2009,30(12):385-387.

Li R T，Liu J C,Jiao Z G.Determintation of phloridzin in apple tree branch and leaf by RP-HPLC [J].Science and Technology of Food Industry,2009,30(12):385-387.(in Chinese)