陕北枣品种群遗传结构的SSR分析

殷 晓，张春梅，李新岗，黄 建，王长柱，练春兰

(1 西北农林科技大学 a 林学院 陕西省林业综合重点实验室，b 园艺学院，陕西 杨凌 712100；2 东京大学 亚洲自然环境科学中心，日本 东京188-0002)

枣(ZiziphusjujubaMill.)是原产于我国的特有果树，栽培历史悠久，约有900个品种[1-2]。长期的栽培与驯化，使其变异类型极其丰富，已形成区域性品种和品种群[2-3]。晋陕黄河峡谷一带是我国栽培枣的原产地和栽培中心[2-4]，也是我国优良制干枣的主要栽培区[2,5]，一直保存着栽培枣的很多原生类型，以及酸枣到枣的中间过渡类型[2,4]。在我国枣的起源地和栽培中心，研究枣的遗传结构对于探明我国枣品种群的形成和发展具有重要意义。

关于枣分子水平的研究，过去主要采用RAPD[6-17]、AFLP[14-15,18-27]、SRAP[6,19,28]、ISSR[29-31]等技术探讨了枣和酸枣的分类地位[6-7,10,12,16,28]、品种鉴定[13,15,17-20]、种质的亲缘关系[7-9,16,18,23-26,28,30]、亲本鉴定[21-22]、遗传图谱[4,28]和遗传多样性[11,19,29,31]等。随着分子技术的发展，由于SSR标记具有多态性高、重复性好、共显性遗传、特异性强等优点[32]，在很大程度上替代了传统的酶标记以及RAPD、AFLP等方法，已广泛应用于遗传结构和种质鉴定研究中[33-35]。近年来，有学者利用SSR标记构建了枣指纹图谱[36]并进行了亲本鉴定[37]，但利用SSR标记对枣品种群遗传结构进行研究尚未见报道。品种群(Cultivar group)是亲缘关系相近的一类品种的集合[1]。一般认为，枣由酸枣演化而来[2,4]，在同一演化路线上的品种遗传背景比较一致，分析品种间的遗传关系，找出基本品种，以此划分品种群，对于指导枣资源利用和育种实践具有重要意义[13,20]。

为进一步阐明枣的遗传结构与品种群分化，本研究针对我国栽培枣的原产地和栽培中心——陕北枣区，选取4个区域(县)8个品种群54份枣种质为研究对象，利用SSR分子标记研究了枣在起源地的遗传结构与亲缘关系，以期揭示枣品种群的分化情况，为枣资源利用和分子辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在陕北黄河峡谷由南向北选取延川、清涧、米脂和佳县4个地理区域(县)，采集陕北原产的团枣、木枣、牙枣、脆枣、疙瘩枣、狗头枣、腰腰枣和辣节节枣等8个枣品种群的54份样品(表1)，样树树龄40年以上，间隔距离500 m以上，并进行GPS定位。参照《中国果树志·枣卷》[2]和《中国枣种质资源》[1]，记录其形态特征和生物学特性。2012-06(花期)采集枣叶片样品，硅胶干燥后于室温密封保存[38]，叶片用于DNA提取。

1.2 枣基因组DNA的提取

用改良CTAB法[39]提取枣基因组DNA。利用QIAGEN TissueLyser Ⅱ高通量组织研磨仪(德国)破碎叶片，60 ℃温浴30 min，先用氯仿/异戊醇(体积比24∶1)抽提，再用等体积异丙醇抽提，用预冷的体积分数80%乙醇沉淀DNA，然后用灭菌超纯水过夜溶解。样品经NanoVue Plus超微量分光光度计(美国)检测后保存于-30 ℃冰箱待用。

表1 陕北原产8个枣品种群的样品来源与用途

1.3 枣DNA的PCR扩增及毛细管电泳检测

选取7个高多态性枣SSR引物(BFU0308、BFU0377、BFU0561、BFU0574、BFU1157[36]和自主开发的Zjuju001和Zjuju021(GenBank序列号分别为KC117400和KC117409))进行PCR。PCR反应体系为10 μL，内含20～30 ng基因组DNA，2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix(德国)5 μL，反向引物和带荧光标记的正向引物分别为3.2和0.8 pmol。按照QIAGEN Multiplex PCR Kit试剂盒(德国)的说明，PCR反应程序如下：95 ℃预变性15 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 90 s，72 ℃ 60 s，30个循环；60 ℃ 30 min。扩增产物由东京大学森林分子生态学研究室ABI 3130XL测序仪(美国)采用毛细管电泳检测，用GeneMapper 4.0软件记录和分析原始数据。

1.4 数据分析

利用GenAlEx 6.5软件分析供试枣的遗传多样性[40]，计算稀有等位基因数(Nr)、等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon’s信息指数(I)、固定系数(F)、近交系数(Fis，Fit，Fst)、基因流(Nm)和Nei’s遗传距离(D)等参数。

根据地理区域(县)与品种群间的Nei’s遗传距离，分别用NTSYSpc-2.10软件[41]中的类平均聚类法(UPGMA)绘制树状图，分析地理区域(县)与品种群间的分化程度。

原始数据经Flexibin软件[42]转化为0/1矩阵后，利用NTSYS软件计算种间Nei’s遗传距离，再用MEGA 5.1软件[43]的邻近距离法(NJ)构建亲缘关系图。

2 结果与分析

2.1 陕北枣种质的遗传多样性

经检测，用7对引物从陕北54份枣种质中共获得42个等位基因，其中引物BFU0308扩增的多态性位点最多(10个)，BFU0561扩增的多态性位点最少(3个)，平均每个位点等位基因数为6。

由表2可知，按地理区域(县)划分，从延川、清涧、米脂和佳县每个区域的枣种质中分别可观察到6，1，1和4个稀有等位基因。有效等位基因数(Ne)为2.464～3.479；Shannon’s信息指数(I)为1.036～1.336；期望杂合度(He)为0.589～0.694，平均观测杂合度(0.909)大于平均期望杂合度(0.634)；固定指数(F)为-0.587～-0.253。

表2 基于地理区域的陕北枣种质的遗传多样性

由表3可以看出，按品种群划分，团枣、木枣、狗头枣和辣节节枣每个品种群内分别可观察到3，2，1和4个稀有等位基因。各品种枣的有效等位基因数(Ne)为1.849～3.496；Shannon’s信息指数(I)为0.567～1.284；期望杂合度(He)为 0.380～0.706，平均观测杂合度(0.922)大于平均期望杂合度(0.555)；固定指数(F)为-1.000～-0.352。其中，狗头枣品种群的Ne、He和I指标均最小，说明其遗传多样性较低，可能与其栽培地域狭窄(仅在延川)、变异类型少有关。

表3 基于品种群的陕北枣种质的遗传多样性

2.2 陕北枣种质的遗传分化

由分子方差检验(AMOVA)检验结果(表4)可知，地理区域(县)内变异(97%)和品种群内变异(91%，88%)均远大于群间分化(3%，9%，12%)；品种群内变异(91%，88%)小于地理区域(县)内变异(97%)。地理区域(县)与品种群的Fis和Fit值均为负值；品种群的Fis值(-0.514，-0.522)小于地理种群(-0.387)，Fit值(-0.308，-0.268)大于地理区域(县)(-0.328)。品种群Fst值(0.136，0.167)大于地理区域(县)(0.042)。品种群间平均基因流(1.584，1.250)均小于地理区域间平均基因流(5.653)。

表4 陕北枣种质群体分化的AMOVA检验结果

图1为4个地理区域(县)枣种质的Nei’s遗传距离UPGMA聚类图。由图1可知，在遗传距离为0.13处4个地理区域(县)种质被划分为2个地理群。无定河(黄河分支)上游的清涧和米脂枣种质遗传距离最近(0.05)，首先聚为一支，然后在遗传距离约为0.09处与佳县聚为第Ⅰ类；第Ⅱ类只有延川一个区域，与其他区域亲缘关系较远, 这与该组中含有狗头枣品种群有关(图2)。

8个枣品种群的UPGMA聚类结果如图2所示。由图2可以看出，在遗传距离为0.99处8个枣品种群被分成2个类群。第Ⅰ类群为团枣-木枣类群，包括团枣、木枣、疙瘩枣、腰腰枣、牙枣和脆枣5个品种群。第Ⅰ类群又可分为3个亚类，其中亲缘关系最近的是木枣品种群与疙瘩枣品种群，其相聚后再与腰腰枣品种群聚在一起，然后又与牙枣聚成一支，形成木枣品种亚类(第1亚类)；第1亚类与第2亚类团枣品种群亲缘关系较近；第3亚类为脆枣品种群，单独为一支，与第1亚类和第2亚类亲缘关系较远。第Ⅱ类群为狗头枣品种亚群，包括延川狗头枣和辣节节枣品种群。

图1 基于Nei’s遗传距离的陕北枣种质地理区域聚类图

2.3 陕北枣种质的聚类分析

由54份陕北枣种质的NJ聚类树(图3)可以看出，供试材料被分为2大类群。第Ⅰ类群共45份种质，又可分为2个亚群，一支包括延川-清涧-米脂团枣品种群(5个延川团枣、3个清涧团枣和2个米脂团枣)、佳县团枣品种群(JXTZ03，JXTZ04和JXTZ05)、木枣品种群(9个佳县木枣、5个延川木枣、3个清涧木枣和2个米脂木枣)、疙瘩枣品种群(YCGD14和JXGD18)、脆枣品种群(YCCZ12和JXCZ17)、牙枣品种群(MZYZ07，JXYZ15和JXYZ16)和腰腰枣品种群(JXYY19和JXYY20)；另一支包括过渡类型的泥河沟酸团枣(JXTZ01)和小会酸团枣(JXTZ02)以及米脂木枣2号(MZMZ04)和狗牙枣1号(MZYZ06)。第Ⅱ类群共9份种质，包括全部的延川狗头枣品种群(5个)、延川脆枣(YCCZ13)和吊牙枣(YCYZ11)、清涧团枣4号(QJTZ04)以及辣节节枣(YCLJ20)。其中，除了清涧团枣4号(QJTZ04)外，延川、清涧和米脂的团枣几乎都聚在一起；佳县枣种质全部在第Ⅰ类群，且各品种群亲缘关系很近；狗头枣品种群与其他枣品种群亲缘关系较远。

图3 基于Nei’s遗传距离的陕北54份枣种质亲缘关系聚类图品种编号同表1

3 讨 论

3.1 枣的遗传多样性

遗传多样性是物种遗传潜力和应对环境变化能力的重要指标，遗传多样性丧失常常导致物种的适合度下降[44]。平均期望杂合度受取样的影响较小，因此常用它来度量群体的遗传多样性，其高低可反映群体的遗传一致性程度[45]。本研究中各地理区域样本的期望杂合度在0.589～0.694，平均期望杂合度为0.634，表明陕北枣在长期驯化与特殊生态环境下发生了中度杂合；其平均Shannon’s信息指数为1.141，说明所分析的枣品种群具有高遗传多样性与高变异性；固定系数与近交系数均为负值，表明供试品种在陕北枣区很少发生近交[46]。闫超等[47]对280个枣品种的结实特性研究后发现，枣树结实多种多样，且供试品种异花授粉均可结实，结实率显著高于自花授粉；其中，陕北品种(牙枣和狗头枣)均为异花授粉，且自花不育。这更好地解释了枣具有较高的杂合性。

本研究中，4个地理区域8个枣品种群均观察到了不同数量的稀有等位基因，其中可能存在与优良性状相关的遗传变异和独特基因型。佳县枣品种的Ne、He和I均最小，而延川最大，说明延川枣种质遗传多样性最高，这与延川包含与其他品种群亲缘关系较远的狗头枣有关。佳县枣种质遗传多样性最低，其原因一方面可能是佳县多为木枣品种群，而木枣品种群内多样性相对于不同品种群间多样性小；另一方面，佳县是最具代表性的栽培枣原产地，这里保存着原始品种类型[2-4]，表型差异明显，但现存的千年古枣树(如JXMZ12，果实圆型，果皮黑红，风味偏酸)与其分化的木枣(如JXMZ11，果实锥型，风味偏酸；JXMZ07，早熟；JXMZ08，抗裂；JXMZ09，晚熟)亲缘关系很近，说明原生木枣品种群的遗传变异不大。

3.2 地理区域与品种群的遗传结构

遗传结构主要通过物种种群内和种群间的遗传分化来体现。遗传分化系数是反映各亚群间遗传分化的重要指标[45]。本研究中，品种地理区域间Fst为 0.042，说明4个区域间基本不存在遗传分化；而7个枣品种群和4个枣品种群间的Fst分别为0.136和0.167，说明品种群间有中度到高度分化。AMOVA结果也表明，地理区域内与品种群内变异均远远大于区域间和品种群间分化，但品种群内部变异较地理区域内变异小。这与枣品种广泛的基因交流(如品种混植)有关，使其均质化[48]；也可能是由于资源一致性生境造成的[2]。这种现象在远交的木本植物中比较普遍，如油橄榄[33]、葡萄[34]，其遗传变异主要存在于居群内。本研究聚类结果表明，枣品种的遗传相似性与地理区域无明显关系，这也是地理区域间基因流较高的一个证据。

本研究中，品种群间平均基因流(7品种群和4品种群Nm分别为1.584和1.250)较小，这很好地印证了品种群间的中高度分化，各品种群在果实形状、大小、品质、丰产性、耐贮性和抗裂性等重要农艺性状上存在很大差异，如脆枣和狗头枣多为大果形，牙枣为小果形；脆枣和牙枣虽品质明显优于团枣和木枣，但耐贮性明显低于团枣和木枣；脆枣皮薄肉脆，抗裂性差、裂果严重，而牙枣抗裂性强；脆枣为鲜食品种，其他多为鲜食、制干兼用品种。品种群UPGMA聚类结果表明，狗头枣品种群与其他品种群，特别是木枣品种群的亲缘关系较远。前人对狗头枣和早熟木枣的染色体核型进行了分析，结果发现，狗头枣核型为2n=2x=24=10m+10sm+4st，不对称性系数高达 64.54%；早熟木枣核型为2n=2x=24=12m+12sm，说明佳县的早熟木枣更原始[49-50]。

3.3 枣种质的遗传关系

枣种质NJ聚类结果表明，疙瘩枣、牙枣、腰腰枣与木枣品种群的亲缘关系很近，极有可能是从原始品种木枣中产生的不同性状变异株系形成的，如第Ⅰ类群中木条枣(YCMZ08，延川眼岔寺)、木疙瘩枣(YCGD14，刘高山村，晚熟，果实方形，果皮黑红)与抗裂木枣(QJMZ05，马牙枣，抗裂)遗传距离几乎为0，而果形有差异，又与长腰腰枣(即驴奶头枣(JXYY20)，果实大，长卵形，品质中上等，质地较致密，制干，抗裂果)聚在一起，品质口感不同，但都不易裂果；螅镇抗裂木枣(JXMZ14，果实小，兼用，抗裂果)与牛奶脆枣(YCCZ12，果实大，品质上等，质地致密细脆，鲜食，易裂果)果实品质与抗裂性不同，但遗传相似性极高。

枣因基因突变和自然杂交等产生了很多变异类型，然后通过自然选择和人为选择等因素逐渐形成区域性枣品种群，这为良种优选奠定了基础。如与其他团枣距离较远的沙团枣(JXTZ04)，平均单果质量13.0 g，品质上等，耐贮藏，丰产性高，抗裂果，是鲜食品种中的优良种质；狗头枣属兼用中晚熟大果型品种，品质上等，耐贮藏，丰产性高，不抗裂果，都聚在第Ⅱ类群，但延川庄头的狗头枣3号(YCGT17)与其他4个狗头枣亲缘关系较远，其原因还有待进一步比较研究。另外，本试验发现同物异名现象，如第Ⅰ类群中狗牙枣1号(MZYZ06，卯疙瘩村，果形小)与米脂木枣2号(MZMZ04，高家渠村，果形小)遗传距离为0，且表型差异小；过渡类型泥河沟酸团枣(JXTZ01，泥河沟)与小会酸团枣(JXTZ02，小会坪)，均为乔木型酸枣到枣的过渡类型，果型、枝、叶与栽培枣相似，果实风味偏酸，核大；第Ⅱ类群中，吊牙枣(YCYZ11)与脆枣(YCCZ13)的果实均脆甜，性状比较相近。

同一区域的枣种质并没有聚在一起，而是按照品种群聚类。枣品种间同时存在同源同型(表型相似，亲缘关系近)、同源异型(表型不同，亲缘关系近)与异源同型(表型相似，亲缘关系远)，说明枣品种的演化有多条路线，同一演化路线上的品种遗传背景比较一致，不同演化路线上的品种也会出现相似的表型特征。花粉形态[51]、同工酶[52]和RAPD[8]研究也证明了这一点。由于本研究所用标记及部分群体内供试样品较少，为探究中国枣品种群的遗传结构，还有待于大范围、跨区域采样，并将SSR标记与更先进的叶绿体基因测序技术结合起来进行研究。

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