日粮能量水平对幼龄獭兔血液生化指标及肝脏PPARγ、INSIG-2基因表达的影响

宋洪新，任战军，杨雪娇，贺国瑞，韩 营，常万波，颉宏兵

(1 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2 甘肃康园有限公司，甘肃 甘谷 741200)

过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)是调控脂肪细胞分化及调节糖脂代谢的重要酶类[1]。在动物生长期，PPARγ能控制脂肪的储存和释放，维持机体能量平衡和血糖的稳定[2]。现有研究表明，PPAR-γ确实与糖脂代谢关系密切，而且PPAR-γ的高表达可能改善糖脂的代谢情况[3-4]。胰岛素诱导基因2 (Insulin induced gene 2, INSIG-2) 是胰岛素诱导基因(Insulin induced gene,INSIG)的一个亚型[5]，是调控脂肪细胞分化和脂类代谢的重要基因，可以调节脂肪合成所需的多种酶的转录[6]，在维持体内胆固醇代谢稳定方面也具有十分重要的作用。INSIG-2与PPARγ均与体内脂质代谢紊乱的发生和发展存在密切关系，因此日益受到人们的关注，有关二者的研究也越来越多，但是有关日粮能量水平对PPARγ、INSIG-2基因表达的影响研究尚较少。本试验以幼龄獭兔为研究对象，通过饲喂不同能量水平的饲料，检测能量水平对其血液指标及INSIG-2、PPARγ基因表达量的影响，旨在从基因水平阐明日粮能量水平对幼龄獭兔糖脂代谢影响的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物及饲养管理 健康状况良好、体质量相近的160只断奶(45日龄)獭兔，由甘肃省甘谷县康园兔业有限公司提供。

1.1.2 试验日粮 试验日粮参照美国NRC(1977)及法国AEC(1993)獭兔的营养需要量，设计能量水平分别为9.7，10.5，11.3，12.1 MJ/kg的4种日料，日粮其他营养成分基本相同，分别含粗蛋白16.5%(质量分数)、粗纤维13%(质量分数)。将日粮加工成直径为4～6 mm 的颗粒饲料备用。

1.1.3 主要试剂及仪器 DNaseⅠ、β-巯基乙醇、TaqDNA聚合酶、oligo(dt)、琼脂糖、RNAprep Pure 动物组织总RNA提取试剂盒(由上海天根生物有限公司提供)、Fast Quant Cdna第1链合成试剂盒(由上海天根生物有限公司提供)。

低温高速冷冻离心机、电泳仪、水平电泳槽、Gel Doc 2000凝胶成像系统、梯度PCR仪、Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(购自美国Thermo Scientific科技有限公司)、CFX96TM Real-Time System 实时荧光定量PCR仪(购自美国BIO-RAD公司)。

1.2 试验设计

试验在甘肃省甘谷县康园(兔业)有限公司进行，试验日期为2012-04-07-06-15，预试期7 d，正试期分为断奶～2月龄和2～3月龄2个阶段。将160只供试獭兔随机分为1，2，3，4共4组，每组40只，单笼饲养，分别饲喂能量水平为9.7，10.5，11.3和12.1 MJ/kg的4种日粮。试验期间每日喂食2次，自由采食，自由饮水。

1.3 日粮能量水平对幼龄獭兔血液生化指标的影响

分别于试验开始后的第30、60天早晨，每组随机选取6只试验兔，空腹称体质量后，心脏采血10 mL/只，肝素钠抗凝，室温避光静置15 min后，3 000 r/min离心10 min，将分离所得血清分装于Eppendorf管中，于-20 ℃下冷冻保存待测。血液指标由杨凌示范区医院检测，测定指标包括葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TC)、高密度胆固醇(HDLC)、低密度胆固醇(LDLC)含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)活性。

1.4 日粮能量水平对幼龄獭兔肝脏中PPARγ、INSIG-2基因表达的影响

1.4.1 引物设计及合成 参照GenBank 公布的兔PPARγ基因序列、INSIG-2基因序列和GAPDH序列，用primer5.0软件设计引物，交由上海生工生物技术有限公司合成。引物序列见表1。

表1 PPARγ、INSIG-2基因及内参基因GADPH的引物序列

1.4.2PPARγ、INSIG-2基因相对表达量的检测 供试獭兔采血后立即屠宰，快速采取肝脏组织相对固定部位样品，放入无酶的Eppendorf管中，每管约0.5 g，每只兔做2管重复，液氮速冻后于-70 ℃保存，用于RNA定量检测。

(1)总RNA的提取。用RNAprep Pure 动物组织总RNA提取试剂盒提取肝脏总RNA，用琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，用紫外分光光度计测定总RNA纯度和浓度，并分别在230，260和280 nm下测定吸光度(OD230、OD260、OD280)，计算OD260/OD280和OD260/OD230值。若RNA样品的OD260/OD280=2.0±0.1，且OD260/OD230值为1.8～2.1，说明提取的RNA纯度较高,适宜进行下一步试验。

(2)反转录。用RNase-Free ddH2O将RNA提取液的质量浓度稀释到50～200 ng/mL。并将试剂在室温下解冻后置冰上保存，且以下所有操作均在冰上进行。

cDNA第1链的合成：取200 μL的RNase-Free 管，加入2 μL RNA提取液、4 μL gDNA、14 μL RNase-Free ddH2O，42 ℃下PCR 孵育3 min后，取出放置在冰上。然后加入4 μL的10×Fast RT Buffer、2 μL的RT Enzyme Mix、4 μL的FQ-RT Primer Mix、10 μL的RNase-Free ddH2O，42 ℃下PCR 孵育15 min，95 ℃下PCR 孵育3 min后得到cDNA样品，取出放置在冰上，分装2管，每管20 μL，-20 ℃保存。

(3)PCR反应。以GADPH为内参基因，进行实时荧光定量PCR扩增。PPARγ、INSIG-2基因PCR扩增的反应体系为：2×UItraSYBR Mixture 5 μL、Template DNA 1 μL、上、下游引物各0.2 μL，RNase-Free ddH2O 3.6 μL。采用两步法进行PCR反应，PCR扩增的反应条件为：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，55 ℃退火60 s，40个循环。融解曲线分析：设置融解曲线温度为60～95 ℃，读取PPARγmRNA、INSIG-2 mRNA和GAPDHmRNA的ΔCt值，以GAPDH作为参照基因，用2-ΔΔCt法计算PPARγ、INSIG-2基因的相对表达量。每个样本重复3次。

1.5 数据处理

采用SPSS(1.8版本)程序对试验数据进行单因素方差分析和显著性检验，用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 日粮能量水平对幼龄獭兔血液生化指标的影响

2.1.1 2月龄獭兔的血液生化指标 从表2可以看出，对于2月龄的獭兔，其血液中的葡萄糖、甘油三酯和总蛋白质含量及乳酸脱氢酶活性均随日粮能量水平的升高而先升高后降低，且均以第3组最高，但各组之间差异不显著；总胆固醇含量逐渐上升，2组与3组含量基本相同，1组与4组之间差异极显著(P<0.01)；高密度胆固醇含量总体呈持续上升趋势，2组和3组含量基本相同，1组与4组之间差异显著(P<0.05)；低密度胆固醇含量呈持续上升趋势，2组和3组含量基本相同，1组与4组之间差异显著(P<0.05)；谷丙转氨酶活性呈逐渐下降趋势，各组之间差异不显著；谷草转氨酶活性呈下降趋势，1组含量最高，与2、3、4组之间差异极显著(P<0.01)；碱性磷酸酶活性先上升后下降，以第3组最高，但各组之间差异不显著。

2.1.2 3月龄獭兔的血液生化指标 从表3可以看出，对于3月龄的獭兔，随着日粮能量水平的升高，其血液中的葡萄糖含量先上升后下降，以第3组含量最高，各组之间差异不显著；甘油三酯含量呈持续上升趋势，各组之间差异不显著；总蛋白质含量先上升后下降，但下降趋势不明显，以第3组含量最高，1组与3组之间差异极显著(P<0.01)，1组与4组之间差异显著(P<0.05)；总胆固醇含量持续上升，且上升趋势比较明显，1组与4组之间差异显著(P<0.05)；高密度胆固醇含量先上升后下降，以第3组含量最高，各组之间差异不显著；低密度胆固醇含量呈持续上升趋势，各组之间差异不显著；谷丙转氨酶先上升后下降，以第1组活性最低，第3组活性最高，2组与3组活性比较接近，各组之间差异不显著；谷草转氨酶活性呈下降趋势，1组与4组之间差异显著(P<0.05)；碱性磷酸酶活性先上升后下降，以第3组活性最高，第1组活性最低，各组之间差异不显著；乳酸脱氢酶活性先上升后下降，以第3组活性最高，第4组活性最低，各组之间差异不显著。

表2 日粮能量水平对2月龄獭兔血液生化指标的影响

表3 日粮能量水平对3月龄獭兔血液生化指标的影响

2.2 日粮能量水平对幼龄獭兔肝脏PPARγ、INSIG-2基因表达的影响

2.2.1PPARγ基因的表达 从表4可以看出，对2月龄獭兔来说，随着日粮能量水平的升高，肝脏PPARγ基因的相对表达量也逐渐升高，以第3组的表达量最高，第1组与2、3、4组之间差异极显著(P<0.01)；对3月龄獭兔来说，随着日粮能量水平的升高，肝脏中PPARγ基因的相对表达量也逐渐升高，但升高幅度很小，以第4组表达量最高，3组与4组之间的表达量基本相同，1组与4组之间差异显著(P<0.05)。总体来看，3月龄獭兔肝脏PPARγ基因的相对表达量较2月龄高。

表4 日粮能量水平对幼龄獭兔肝脏PPARγ基因相对表达量的影响

2.2.2INSIG-2基因的表达 从表5可以看出，对2月龄獭兔来说，随日粮能量水平的升高，肝脏INSIG-2基因的相对表达量呈先上升后下降趋势，以第3组表达量最高，1组与3组之间差异显著(P<0.05)；对3月龄獭兔来说，随日粮能量水平的升高，肝脏INSIG-2基因的相对表达量呈逐渐下降趋势，以第1组表达量最高，1组与4组之间差异极显著(P<0.01)，2组与4组之间差异显著(P<0.05)。

表5 日粮能量水平对幼龄獭兔肝脏INSIG-2基因相对表达量的影响

3 讨 论

3.1 日粮能量水平与血液生化指标

血液生化指标能够反映动物机体的物质代谢水平和某些组织器官的机能状态[7]。正常情况下，动物体内各血液生化指标的量值呈相对稳定状态，但不同的日粮组成却能通过影响动物的血液生化值，进而影响动物机体的代谢以及健康状况。

葡萄糖作为重要的营养性单糖，是机体新陈代谢的能源物质。血液中的葡萄糖含量与动物能量摄入量有关[8]，可以反映机体的能量代谢水平。本试验发现，随着日粮能量水平的升高，2、3月龄獭兔血液中的葡萄糖含量均先上升后下降，但变化幅度不大，表明血液中的葡萄糖含量在一定范围内会随日粮能量水平的升高而升高，但机体可以通过葡萄糖-脂肪酸代谢途径来调节血液中的葡萄糖含量[9],以保证血液中的葡萄糖含量处于恒稳状态，这与吴淑军等[10]的研究结果一致。

甘油三酯和胆固醇是血液脂肪的组成部分，其水平可间接反映全身脂类代谢状况，脂类在体内发生运输障碍时，血脂含量会有所升高[11]。本试验中，随着日粮能量水平的升高，2、3月龄獭兔血液中的甘油三酯和胆固醇含量均呈上升趋势，这与王宗伟等[12]的研究结果基本一致，表明高能量水平可以提高血液中的甘油三酯和胆固醇含量，且对胆固醇的影响更为明显。

高密度胆固醇和低密度胆固醇是胆固醇的运输者，本试验中，随着胆固醇含量的增高，二者也呈上升趋势，表明随着日粮能量水平的升高，高密度胆固醇和低密度胆固醇的含量也随之升高。对于2月龄獭兔，日粮能量对高密度胆固醇的影响更显著一些，对于3月龄獭兔，日粮能量对低密度胆固醇的影响更显著一些。这可能与高密度胆固醇和低密度胆固醇的功能不同有关，低密度胆固醇的功能主要是将胆固醇从肝脏运送到全身组织，高密度胆固醇的功能正好相反，是将各组织中的胆固醇运送回肝脏。对于2月龄獭兔来说，日粮能量水平越高，血液中的胆固醇含量越高，这时需要高密度胆固醇将血液中的胆固醇运送到肝脏中进行代谢；而3月龄獭兔由于长时间饲喂高能日粮导致体内沉积的胆固醇含量较高，肝脏不能快速对其进行代谢，所以向肝脏运送胆固醇的高密度胆固醇含量就会减少，从肝脏运出胆固醇的低密度胆固醇含量就有所增多。

血液中总蛋白含量的多少,可以反映机体蛋白质摄取量的多少[13]，本试验高能组血液中总蛋白含量的下降，主要是因为采食量下降引起的。日粮能量过高，獭兔采食量下降，导致蛋白质的摄入量也随之下降。

酶是动物机体新陈代谢的有效调节剂，酶活性的大小直接影响着动物的新陈代谢水平,进而影响动物的健康和生长状况[14]。谷丙转氨酶和谷草转氨酶在氨基酸代谢中起重要作用，二者活性升高时，可使蛋白质分解代谢下降，合成代谢加强，有利于氮在体内的蓄积，动物生长较快[14]。本试验中，随着日粮能量水平的升高，这2种酶总体呈下降趋势，表明机体的氨基酸代谢水平随着日粮能量水平的升高而有所下降。碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶都是与生长发育和消化代谢有关的重要酶，碱性磷酸酶是消化代谢的关键酶，其活性在一定程度上可以反映獭兔的生长速度[15]。本试验中，随着日粮能量水平的升高，碱性磷酸酶的活性先上升后下降，表明在一定的能量范围内，随着能量水平的升高，碱性磷酸酶活性升高，但影响不显著。乳酸脱氢酶是机体能量代谢过程中参与糖酵解的一种重要酶，与血糖含量有关，本试验中，能量水平对乳酸脱氢酶含量的影响不显著。总体来说，日粮能量水平对幼龄獭兔血液中的总蛋白质、总胆固醇、高密度胆固醇、低密度胆固醇和谷草转氨酶含量都有显著影响，但对其他血液指标的影响相对较小。

3.2 日粮能量水平与PPARγ、INSIG-2基因的表达

PPARγ不仅调控机体的脂肪代谢、维持能量平衡和血糖的稳定，同时又调控着参与脂类代谢的相关基因的表达[2]。本试验结果表明，随着日粮能量水平的升高，PPARγ基因的表达量也相应增高，2、3月龄獭兔PPARγ基因的表达量分别在日粮能量水平为11.3和12.1 MJ/kg时达到最高值，且3月龄獭兔PPARγ基因表达量总体高于2月龄，说明高能量水平的日粮能促进PPARγ基因的表达。

INSIG-2在维持体内胆固醇代谢稳定方面也具有十分重要的作用。本试验中，INSIG-2基因在2、3月龄时分别于11.3 和9.7 MJ/kg的日粮能量水平下表达量最高。INSIG-2基因的表达量并非简单地随血液胆固醇含量的变化而变化，而可能与INSIG-2在调控脂类代谢的同时也调控参与脂类代谢所需的多种酶的表达有关，INSIG-2、PPARγ在其他一些与糖脂代谢有关的酶的共同作用下，对动物机体的糖脂代谢进行调控，在这一复杂的机制下，使INSIG-2基因的表达量不会简单地随着日粮能量水平的升高而升高。有关日粮能量水平对其他与糖脂代谢有关基因表达量的影响，以及各种基因调控糖脂代谢的机制还有待进一步研究。

4 结 论

2月龄时，日粮能量水平对獭兔血液中的总胆固醇、高密度胆固醇、低密度胆固醇含量和谷草转氨酶活性有显著影响；3月龄时，日粮能量水平对獭兔血液中的总蛋白质、总胆固醇含量和谷草转氨酶活性有显著影响。2、3月龄时，日粮能量水平对幼龄獭兔肝脏PPARγ、INSIG-2基因的表达量均有显著影响，在2、3月龄獭兔肝脏中，PPARγ基因分别在11.3和12.1 MJ/kg 日粮能量水平下的表达量最高，INSIG-2基因则分别于11.3 和9.7 MJ/kg的日粮能量水平下表达量最高。

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