云南干热河谷地区木棉科植物丛枝菌根真菌的调查研究

伍建榕，汪 洋，赵春燕，陆青华，高 柱，王 芳，马焕成

(1 国家林业局 西南地区生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224；2 西南林业大学 林学院 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，云南 昆明 650224)

木棉科(Bombacaceae)植物大多属乔木或灌木，是优良的行道树树种。近年来的研究发现，木棉具有重要的经济和观赏价值，对其的需求量急剧增加。木棉科植物是木本纤维林发展的优先树种，其果内棉毛可作枕、褥、救生圈等的填充料,以其取代化纤，可减少对石油的依赖，也可为我国石油能源安全和粮食安全提供支持[1]。木棉还具有耐贫瘠、抗干旱、固土功能强及发达的菌根系统等特点，可栽植于立地条件较差的荒山坡地。菌根真菌能在极端干旱条件下与树木形成共生系统,为树木提供水分和必需的营养元素,从而帮助植物抵御干旱[2]。目前，对草本和灌木的丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizae fungi，AMF)已有报道[3],但有关云南干热河谷区域内高大乔木木棉树种丛枝菌根真菌的研究尚未见报道。本研究对云南干热河谷地区木棉科植物根及根际周围AMF的分布状况进行了调查，旨在为筛选对干热河谷木棉生长有明显促进作用的AMF菌种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 调查区域概况

调查区域位于云南省红河州个旧市保和乡冷墩村，为云南攀大木棉科技应用有限公司的种植基地，地处102°56′48.09″～102°57′14.01″ E，23°11′19.48″～23°11′59.26″ N，海拔319～425 m，属典型的干热河谷气候。调查区域年均气温25.12 ℃，极端最高气温47.5 ℃，最低气温0 ℃；无霜期363 d；日照时数1 770.2 h；年均降雨量低于700 mm，蒸发量大于降雨量，且雨季和旱季分明，6-9月为雨季，降雨量占全年降雨量的85%以上，2-5月几乎无雨，严重干旱。土壤为燥红土，0～20 cm土层土壤理化性质为pH 7.03，有机质14.58 g/kg，碱解氮12.4 mg/kg，速效钾51.4 mg/kg,速效磷0,非常适宜木棉树的生长[4]。

1.2 AMF的分离与鉴定

于2011-01-2012-01，分雨季和旱季在云南干热河谷地区的元阳、元江、元谋、东川、宾川和怒江6个区域，采集野生及人工栽培木棉科树种根区须根及须根所带土壤样品共54份。取所采集的土壤样品20 g放入150 mL无菌蒸馏水中,用磁力棒均匀搅拌10 min或自然浸泡30～40 min，然后用浙江上虞市华丰五金仪器有限公司生产的孔径为850，425，150，106，75和38 μm的筛进行湿筛[5]收集孢子，将孢子及残留物用自来水反复冲洗后转移至培养皿中，在体视镜(LEICAS6E)下将形态相近的AMF孢子检出。将分离检出的AMF孢子分别放在蒸馏水、乳酸、乳酸甘油和Melzer’s 试剂[6-7]中观察，记录孢子的分类特征并拍照。参照Schench等[8]、http://invam.caf.wvu.edu图谱对照及近几年研究成果，对AMF孢子进行鉴定，并于显微镜(NikonE800)下测量孢子形态,鉴定到种[9-10]。标本存放在西南林业大学林学院森林病理实验室。

1.3 菌根侵染率检测

菌根侵染率检测采用Phillips等[11]的染色方法。将采集的木棉根系用自来水冲洗后剪成1 cm长的根段，置于FAA固定液中固定24 h后用自来水冲洗，加入质量分数10% KOH溶液浸透根样，90 ℃水浴中保温1 h，用清水洗去KOH，加碱性H2O2(3 mL NH4OH+30 mL质量分数10% H2O2+60 mL H2O混匀)软化根段，室温下放置20 min，洗去碱性H2O2。加入质量分数1% HCl 3～4 min酸化后，加入质量分数0.05%曲利苯蓝染色液于90 ℃水浴中保温30 min,使染料快速渗透到根组织和菌根真菌细胞中。染色后，将根样放到乳酸甘油中浸泡以除去多余的染料，使菌根的菌丝、泡囊和丛枝保持染色状态，然后制片，在显微镜下观察菌丝、泡囊、丛枝的结构特征，确定菌根的结构类型。统计根段中AMF侵染的根段数，计算菌根侵染率和侵染强度[12]。

菌根侵染率=(AMF侵染的根段长/检查根段总长)×100%。

侵染强度分为5个等级[13]：1级，受侵染的营养根数占观察总根数的0～5%；2级，受侵染的营养根数占观察总根数的6%～25%；3级，受侵染的营养根数占观察总根数的26%～50%；4级，受侵染的营养根数占观察总根数的51%～75%；5级，受侵染的营养根数占观察总根数的76%～100%。

1.4 AMF孢子密度的测定

从带根土样中取100 g风干土2份，1份在105 ℃下烘干至恒质量，测定土壤含水量；另1份用湿筛倾析法[13]分离孢子于培养皿内，在解剖镜下分格计数(孢子果按1个孢子计数)，按下列公式计算孢子密度[14]，各土样均重复3次。

土壤含水量=(土壤湿质量-土壤干质量)/土壤湿质量×100%。

孢子密度=孢子总数/[土壤湿质量×(1-土壤含水量)]。

2 结果与分析

2.1 云南干热河谷地区木棉AMF的种类及鉴定

从云南干热河谷地区所采集的54份样品中，共分离出3属6种AMF,分别为幼套球囊霉Claroideoglomusetunicatum(W.N. Becker & Gerd.) C.Walker & A.Schüβler、摩西球囊霉Funneliformismosseae(T.H.Nicolson & Gerd.) C.Walker & A.Schüβler、何氏球囊霉GlomushoiBerch & Trappe、缩球囊霉Funneliformisconstrictum(Trappe) C.Walker & A.Schüβler 、苏格兰球囊霉Glomuscaledonium(Nicol.& Gerd)Trappe & Gerd和细凹无梗囊霉AcaulosporascrobiculataTrappe，其形态见图1。6种AMF中，幼套球囊霉和摩西球囊霉较其他种类出现频率更高，孢子数量较多,初步认为这2种是云南干热河谷地区木棉科植物AMF的优势种。

2.1.1 幼套球囊霉 厚垣孢子土壤中单生，黄色或棕黄色，圆形或近圆形，直径90～155 μm。孢壁2层，外层无色透明，厚2～5 μm；内层黄色或黄棕色，厚4～6 μm。未成熟的厚垣孢子有外壁完整的外套，成熟后易脱落,连孢菌丝大部分脱落，但常可见残留物存在[15]。

2.1.2 摩西球囊霉 厚垣孢子土壤中单生，或在根和孢子果内，淡黄或淡黄棕色，圆形至近圆形，直径130～160 μm。孢壁2层，外层无色透明，厚0.5～1 μm，成熟后常脱落；内壁淡黄或浅黄棕色，厚1.5～2.0 μm；孢壁在连点处增厚至6 μm左右，连点漏斗状，宽15～25 μm，漏斗底部有厚凹隔[16]。

2.1.3 何氏球囊霉 厚垣孢子土壤中单生，孢子淡黄棕色，圆形至近圆形，直径90～110 μm。孢壁2层，外层浅黄棕色，厚3～4 μm；内层无色透明，厚≤1 μm；孢子破裂后有皱折，连点直或小喇叭形[11]，宽11～15 μm，连孢菌丝宽为9～11 μm，壁厚2～3 μm[14]，在Melzer’s试剂中孢子呈桔黄色。

2.1.4 缩球囊霉 厚垣孢子土壤中单生，深黄棕色至深红棕色或黑色，光滑发亮，圆形、近圆或长圆形，直径120～190 μm。孢壁1 层，厚5～7 μm；连点缢缩明显，宽11～13 μm，连点处由孢壁封闭，或不封闭，仅留一狭小孔道[17]，连孢菌丝在连点下方膨大至17～23 μm，淡至黄棕色，并常向孢子一侧弯曲，连点后菌丝变细至7～11 μm，菌丝有一分隔，隔下菌丝常双叉分枝，无色或淡黄色。

2.1.5 苏格兰球囊霉 厚垣孢子土壤中单生，孢子淡黄色,圆形至近圆形,直径120～250 μm。孢壁2层，外层无色透明,厚1～2 μm，外壁在连点处略增厚,易和内壁分离；内壁淡黄色,厚2～8 μm,连点宽10～35 μm,直或小喇叭形,外壁伸入连孢菌丝一段距离,连点处有一薄隔[18],连孢菌丝宽9～12 μm,色浅。

2.1.6 细凹无梗囊霉 厚坦孢子在土壤中单生，孢子侧生在漏斗状的连孢菌丝上，菌丝近端有一大小与孢子相仿的产孢子囊，孢子完全成熟后产孢子囊即萎缩变空。孢子圆形至近圆形，幼时无色、透明，成熟后淡黄至黄褐色，直径110～150 μm。孢壁4层，外壁淡黄、黄褐色，厚5～6 μm，表面有凹坑形纹饰，凹坑形态为圆形、长形、多角状，或几个相连成不规则的弯曲形，面积(1～5) μm×(1～3) μm，凹深1～2 μm，凹坑有时密集，有时稀疏，但大部分情况下布满孢子表面；内壁为3层，无色透明膜状壁，厚<1 μm；第3层有时有粗糙不平的麻点；第4层易与外面的壁分离[17]，在Melzer’s试剂中染成深红色。

图1 云南干热河谷地区木棉丛枝菌根真菌形态鉴定

2.2 AMF在木棉根中的侵染率及孢子密度分布特征

在云南干热河谷地区采集的木棉科植物的丛枝菌根中，通过染色可观察到根内的菌丝、泡囊及丛枝(图2)。对云南干热河谷不同地区、不同季节及野生和人工种植区木棉AMF的侵染率、孢子密度和侵染强度进行调查，并在元阳县6个乡镇6种植被类型中进行调查，结果见表1～4。

图2 木棉AMF外观形态及在木棉根部的菌丝和孢子

由表1～4可见，在调查的云南干热河谷的元阳、元江、东川、元谋、宾川和怒江6个地区中，野生木棉科植物的AMF均为6种，菌根侵染率分别为76.8%～80.7%,60.7%～60.5%,86.8%～80.7%,76.8%～80.7%,66.8%～80.7%和 87.5%～88.9%；孢子密度分别为198.4,98.5,109.6,98.9,148.9和143.4个/g。在所调查的野生木棉根中，均被6种AMF所侵染，菌根侵染率达到76.8%～80.7%，孢子密度达到198.4个/g；而人工种植的木棉根中，仅被5种AMF所侵染，菌根侵染率为50.7%～60.5%，孢子密度为98.5个/g。雨季的厚垣孢子数量较多，为188.4个/g；旱季较少，为90.5个/g。香蕉林植被的木棉菌根侵染率最高，可达到90.3%～90.7%，孢子密度达156.4 个/g；河谷边的木棉菌根侵染率最低，仅为 62.8%～60.3%，孢子密度为89.3个/g。

表 1 云南干热河谷 6个区域木棉AMF孢子密度、侵染率及侵染强度的比较

表 2 云南干热河谷地区元阳野生和人工木棉种植区AMF孢子密度、侵染率及侵染强度的比较

表 3 不同季节野生木棉AMF孢子密度、侵染率及侵染强度的比较

表 4 元阳县6个木棉自然生长点不同植被类型AMF孢子密度、侵染率及侵染强度的比较

3 结论与讨论

AMF具有丰富的物种多样性[18]和遗传多样性。Sykorová等[19]证实,AMF群落组成受到寄主植物种类的影响, 生长习性不同或起源、遗传背景复杂的一些多年生木本植物会影响丛枝菌根真菌的多样性[20]。本试验从云南干热河谷的6个典型地区的野生及人工栽培木棉科树种须根及其所带土壤中，分离鉴定出3属6种AMF，其中，幼套球囊霉和摩西球囊霉较其他种类出现频率高,孢子数量多，初步认为这2种是云南干热河谷地区木棉丛枝菌根真菌的优势种。本研究还发现，AMF的分布在不同季节也不相同，土壤干旱会降低AMF的产孢能力和侵染活性，雨季的厚垣孢子数量较多，旱季较少；不同的植被类型也影响AMF厚垣孢子的数量，植被类型多的林地孢子数量比土壤植被类型少的林地(相对贫瘠的)少。值得重视的是, 本研究发现土壤水分含量(旱季和雨季)与AMF对树木根的侵染率密切相关，这与李晋等[7]的研究结果一致。

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