曼地亚红豆杉细胞悬浮培养体系的建立

赵继鹏，杨淑慎

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

紫杉醇(Taxol)是存在于红豆杉科红豆杉属植物中的一种四环二萜酰胺类化合物，经临床证明，其对治疗卵巢癌、肺癌等多种癌症有特效，市场需求量日益增加[1]。但由于其药源植物红豆杉生长缓慢，且紫杉醇含量极低(0.01%～0.02%)，无法满足市场需求[2]。

曼地亚红豆杉(Taxusmedia)是东北红豆杉与欧洲红豆杉的天然杂交品种。该植物枝叶茂盛，生长速度快，对环境适应能力强，能在多种气候和土壤条件下生长，且树皮和枝叶中均含有紫杉醇(0.04%左右)，因此成为提取紫杉醇的最佳原料[3]。

目前, 紫杉醇的生产途径主要有:从树皮中提取、化学合成、真菌生产和植物细胞培养等。其中细胞培养具有原料丰富、大规模反应较易实现等优点，因此成为工业化生产紫杉醇的最佳途径[4]。本研究以曼地亚红豆杉愈伤组织为材料，以愈伤组织接种量、蔗糖质量浓度、激素类型及配比和防褐化试剂为考察因素，通过单因素试验或正交试验，对曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的培养基组成和培养条件进行优化，以期为大规模培养红豆杉细胞、扩大紫杉醇生产量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料为曼地亚红豆杉愈伤组织：从西北农林科技大学博览园中栽培的7年生曼地亚红豆杉采集幼茎，在西北农林科技大学生命科学学院细胞工程实验室中，经过5次以上继代生长获得。

1.2 曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的影响条件

1.2.1 愈伤组织接种量对细胞悬浮培养的影响 以蔗糖质量浓度为30 g/L且不含激素的液体B5培养基为基本培养基，每个50 mL锥形瓶中加入12.5 mL液体B5培养基，愈伤组织接种量设置0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 g/mL 5个水平，培养15 d后，测定细胞的生物量与褐化程度。每样品设3个平行试验，研究愈伤组织接种量对曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的影响。

1.2.2 蔗糖质量浓度对细胞悬浮培养的影响 以不含激素的液体B5培养基为基本培养基，设置20，25，30，35，40 g/L 5个不同蔗糖质量浓度，愈伤组织接种量为1.25 g/瓶，培养15 d后，测定细胞的生物量。每样品设3个平行试验，研究蔗糖质量浓度对曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的影响。

1.2.3 激素类型及配比对细胞悬浮培养的影响 以蔗糖质量浓度为30 g/L的液体B5培养基为基本培养基，愈伤组织接种量为1.25 g/瓶，选择2,4-D、NAA、KT 3种激素进行单因素试验，激素单因素试验水平设计为：2,4-D (0,0.1,0.3,0.5,0.7,0.9 mg/L)，NAA(0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mg/L)，KT (0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/L)。在单因素试验的基础上，进行三因素三水平正交试验(表1)，培养15 d后,根据细胞的生物量与褐化程度确定激素的最优组合，每样品设3个平行试验。

表 1 激素配比对曼地亚红豆杉细胞悬浮培养影响的L9(34)正交试验因素设计

1.2.4 防褐化试剂对细胞悬浮培养的影响 以B5+2,4-D 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L为基本培养基，愈伤组织接种量为1.25 g/瓶，选取柠檬酸、PVP和水解乳蛋白3种防褐化试剂进行单因素试验，防褐化试剂单因素试验水平设计为：柠檬酸 (0(对照CK),100,200,300,400,500 mg/L)，PVP (0(对照CK),100,300,500,700,900 mg/L)，水解乳蛋白 (0(对照CK),100,300,500,700,900 mg/L)。根据单因素试验结果进行三因素三水平正交试验(表2)，研究3种防褐化试剂对细胞悬浮培养的影响，以获得最佳的防褐化试剂组合，每样品设3个平行试验。

表 2 3种防褐化试剂对曼地亚红豆杉细胞悬浮培养影响的L9(34)正交试验因素设计

1.3 测定指标及方法

1.3.1 愈伤组织的指标测定 (1)褐化程度的测定。 观察愈伤组织的颜色，将其褐化程度分为4个等级[5]。1级：表示没有褐化；2级：表示轻微褐化；3级：表示褐化严重；4级：表示褐化很严重。(2)细胞鲜质量的测定。 曼地亚红豆杉悬浮培养细胞5 000 r/min离心10 min,去掉上清液，沉淀物用滤纸吸干剩余水分，然后称其鲜质量。(3)愈伤组织增殖指标。 增质量(g)=每瓶悬浮细胞鲜质量-愈伤组织接种量；增殖倍数=增质量/接种量；比鲜质量增长率(d-1)=增质量/愈伤组织接种量×培养时间[6]。

1.3.2 紫杉醇含量的测定 将1.3.1中离心获得的细胞在40 ℃条件下烘干至恒质量，研磨，称取0.1 g细胞干样置于试管中，加入乙酸乙酯-丙酮(体积比为1∶1)10.0 mL，浸提24 h，超声处理20 min后过滤，将滤液于40 ℃下旋转蒸发至浸膏状，再用二氯甲烷-水(体积比为1∶1) 10.0 mL进行2次萃取，取有机相，水相中则再加入等体积的二氯甲烷萃取，合并有机相，在旋转蒸发仪上于40 ℃下浓缩至干燥，用甲醇10.0 mL定容[7-10]。采用文献[8]中的方法进行细胞内紫杉醇含量的测定。

1.4 曼地亚红豆杉细胞悬浮培养体系的验证

以B5+2,4-D 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+柠檬酸220 mg/L+PVP 350 mg/L+水解乳蛋白450 mg/L +蔗糖30 g/L为培养基，愈伤组织接种量为1.25 g/瓶，在每个50 mL培养瓶中装12.5 mL液体B5培养基(均已高压灭菌，灭菌前pH=5.8)，在培养箱中110 r/min、25 ℃黑暗振荡培养。从培养的第1天起到第31天，每隔3 d取1次样，3次重复。根据细胞鲜质量计算细胞的增殖倍数，绘制生长曲线；根据细胞内的紫杉醇含量绘制紫杉醇含量变化曲线。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织接种量对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞生长的影响

2.1.1 对悬浮细胞生长的影响 愈伤组织接种量对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞生长的影响见图1。由图1可以看出，在愈伤组织接种量低于0.08 g/mL 时，曼地亚红豆杉悬浮培养细胞生长缓慢，当接种量为0.10 g/mL时，细胞的比鲜质量增长率达到最大，统计分析表明达差异显著水平(P<0.05)。说明细胞密度需积累到一定程度才有利于细胞悬浮生长，接种量稍大或稍小均不利于细胞生长。

图1 愈伤组织接种量对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞生长的影响

2.1.2 对悬浮细胞褐化的影响 由表3和图2可以看出，曼地亚红豆杉愈伤组织接种量对细胞褐化的影响很大。随着接种量的增大，细胞褐化的程度逐渐加重，接种量为0.12和0.14 g/mL的细胞褐化严重，这可能是因为接种量大，细胞密度高，养分不足，致使细胞褐化加重。

综合接种量对细胞生长和细胞褐化的影响，细胞悬浮培养中曼地亚红豆杉愈伤组织接种量以0.1 g/mL较适宜。

表 3 愈伤组织接种量对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞褐化的影响

图2 愈伤组织接种量对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞褐化的影响

2.2 蔗糖质量浓度对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞生长的影响

图3显示，蔗糖质量浓度对曼地亚红豆杉细胞悬浮培养具有较大的影响，在蔗糖质量浓度为20～30 g/L时，悬浮培养细胞的生长率呈上升趋势；当蔗糖质量浓度高于30 g/L时，细胞的比鲜质量增长率呈下降趋势，所以选择30 g/L作为曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的适宜蔗糖质量浓度。

2.3 激素类型及配比对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞生长的影响

从图4可知，在曼地亚红豆杉悬浮培养体系中，2,4-D、NAA和KT 3种激素的适宜质量浓度分别为0.7，1.0和1.0 mg/L；且均表现为随着激素质量浓度的增加，悬浮细胞的比鲜质量增长率呈先增加后降低的趋势。

图3 蔗糖质量浓度对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞生长的影响

图4 2,4-D、NAA和KT 3种生长激素对曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的影响

以3种激素的单因素试验结果为基础进行正交试验，结果见表4。从表4可知，3种激素的最佳配比为A1B1C2:2,4-D 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L，3种激素对曼地亚红豆杉愈伤组织增殖的影响大小为NAA>KT>2,4-D。

表 4 2,4-D、NAA和KT 3种生长激素对曼地亚红豆杉细胞悬浮培养影响的正交试验结果

2.4 防褐化试剂对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞生长的影响

防褐化试剂柠檬酸、PVP和水解乳蛋白对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞生长影响的单因素试验结果见表5。由表5可以看出，3种防褐化试剂均能有效降低细胞的褐化程度，且对细胞生长有促进作用，均表现为随着防褐化试剂质量浓度的增加，悬浮细胞的增殖倍数呈先增高后降低的趋势，柠檬酸、PVP、水解乳蛋白的最适质量浓度分别为200，300和500 mg/L。

表 5 3种防褐化试剂对曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的影响

以3种防褐化试剂的单因素试验结果为基础进行正交试验，结果见表6。表6表明，防褐化试剂的最佳配比为A3B3C1：柠檬酸220 mg/L+PVP 350 mg/L+水解乳蛋白450 mg/L， 3种防褐化试剂对悬浮细胞生长的影响大小依次为柠檬酸>PVP>水解乳蛋白。对比表5和表6可以发现，正交试验中曼地亚红豆杉愈伤组织的最大增殖倍数低于单因素试验中水解乳蛋白为500 mg/L时的细胞增殖倍数，这是因为在正交试验中，各组的试剂配比未达到3种防褐化试剂的最佳配比，且PVP可能对水解乳蛋白和柠檬酸产生吸附作用，降低了其在悬浮培养液中的实际质量浓度。

表 6 3种防褐化试剂对曼地亚红豆杉细胞悬浮培养影响的正交试验结果

2.5 曼地亚红豆杉细胞生长曲线和紫杉醇含量变化曲线

在最佳的悬浮培养体系中，曼地亚红豆杉细胞的生长曲线(图5-A)体现了红豆杉细胞生长缓慢的特点，在培养前4 d细胞鲜质量变化不明显，接种后第5天细胞迅速生长，16 d时，细胞增殖倍数达到3左右，细胞生长进入稳定期。细胞内紫杉醇含量在培养前7 d逐渐减少(图5-B)，10 d时紫杉醇含量开始增加；22 d时细胞内的紫杉醇含量趋于稳定。这可能是因为培养液内碳源等营养物质不断消耗，使细胞生长受到影响，因此紫杉醇含量的增幅减小。

图5 曼地亚红豆杉细胞生长曲线(A)和紫杉醇含量变化曲线(B)

3 讨 论

通过红豆杉细胞培养生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题的有效途径，国内许多研究者做了大量有价值的探索，但是对我国大面积种植的曼地亚红豆杉的研究较少[11-12]。本试验通过对曼地亚红豆杉悬浮培养条件的研究，建立了曼地亚红豆杉细胞悬浮培养体系。

建立良好的细胞悬浮培养体系是进行大规模细胞培养的必要准备[13]。本试验发现，曼地亚红豆杉细胞的接种量以0.1 g/mL为最佳，接种量低于0.1 g/mL时，细胞不能很好地生长；高于0.1 g/mL时，细胞很快会褐化，影响细胞的生长。蔗糖是细胞生长的重要碳源,适宜质量浓度的蔗糖能提高培养细胞的生长速率，而较高的蔗糖质量浓度则容易使细胞产生褐变[14]。本研究结果表明，利于曼地亚红豆杉细胞生物量增加的蔗糖质量浓度以30 g/L为最优，当蔗糖质量浓度高于30 g/L时,细胞褐化严重,影响细胞的正常生长。

植物生长激素能够促进植物细胞的生长和繁殖，但是较高质量浓度的激素反而会对细胞生长起抑制作用，合适的激素类型和配比是悬浮体系建立成功与否的关键[15-16]。有研究表明，外源2,4-D 有利于愈伤组织的生长[17]，但对次生代谢物的合成往往有抑制作用[18]。如司徒琳莉等[19]在东北红豆杉细胞培养研究中发现，培养基中添加一定质量浓度的 2,4-D 可以显著提高细胞的生长速率，增加生物量；同时再添加适宜质量浓度的NAA 和KT则可以提高紫杉醇的积累。本试验结果显示，在曼地亚红豆杉细胞培养中，2,4-D、NAA和KT 3种激素的适宜配比为：2,4-D 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L；3种激素对曼地亚红豆杉细胞生长的影响大小依次为NAA>KT>2,4-D。

防褐化试剂(如水解乳蛋白和柠檬酸)可以有效抑制细胞的褐化，延长细胞的生长周期，且一些防褐化试剂可以促进细胞的生长和细胞内紫杉醇含量的提高[20-24]。本试验发现，水解乳蛋白、PVP和柠檬酸3种防褐化试剂对曼地亚红豆杉悬浮培养细胞褐化具有明显的抑制作用，且以柠檬酸对细胞生长的影响最大。

本研究建立的曼地亚红豆杉细胞悬浮培养体系，对于通过细胞培养生产临床急需的抗肿瘤药物紫杉醇具有极其重要的价值，对工业化生产紫杉醇也将产生极大的促进作用。

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