抗CMV和ToMV RNAi载体的构建及加工番茄遗传转化

乔亚红，田桂英，郑银英，崔百明，李诗林，向本春

(石河子大学 农学院 农业生物技术重点实验室，新疆 石河子 832003)

病毒病是加工番茄生产中的主要病害之一。近年来，随着加工番茄的大面积种植和连续种植，连作和重茬增多，病毒病害也日趋严重。黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)和番茄花叶病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)是严重危害加工番茄的2种主要病毒[1-2]。其中,CMV属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)，是目前世界范围内危害蔬菜最严重的病毒之一。ToMV是与烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)关系最近的一种病毒，属于烟草花叶病毒属，其寄主范围广,能侵染茄科、禾本科、十字花科、豆科等许多植物。在实际生产中，这2种病毒往往是复合侵染加工番茄，使加工番茄枝条上出现严重的条斑坏死症状，果实表面则生成褐色斑块，僵小畸形，严重影响了加工番茄的产量和品质，给农业生产造成了较大的经济损失[3-6]。

RNAi 是生物体本身的一种RNA防御机制，普遍存在于植物、动物和真菌等大多数真核生物中[7-9]。植物体天然的 RNAi 系统不能完全抵御某种病毒的入侵，如果人为地将该病毒的某一段序列设计成含反向重复的结构双链，转入植物体内，使其在植物体内表达从而诱发RNAi 产生 dsRNA，可有效地强化植物体自身的 RNAi 抗病毒机制，获得较高抗性的转基因植物，达到延迟和减轻病毒病害的目的。目前，该技术已广泛应用于植物抗病毒方面的研究，并取得了很好的效果[10-12]。Waterhouse等[13]针对马铃薯 Y 病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建 IRS 载体，用其转化烟草获得了抗性植株。Wang等[14]用大麦黄矮病毒(BYDV-PAV)多聚酶基因的反向重复序列载体转化大麦，获得了对BYDV免疫级抗性的转基因大麦植株。朱俊华等[15]将 PVYCP部分序列的反向重复序列载体转化烟草, 获得了对PVY免疫的转基因植株。颜培强等[16]利用 TMVCP和 CMVCP部分序列的融合基因片段构建载体转化烟草，获得了抗TMV、CMV的转基因烟草植株。但实际生产中，往往是多种病毒复合侵染同一寄主植物，利用RNAi技术，可以将多个病毒部分基因序列进行融合，构建抗多种病毒的载体，转化植株后即可获得具有抗多种病毒能力的植株。

本研究利用 RNAi 技术，分别选取新疆加工番茄 CMV 分离物 NS0-4 和 ToMV 分离物SCS-2，以二者的复制酶部分序列作为干扰片段，通过 T 克隆载体拼接，构建含反向重复结构拼接片段的 RNAi 表达载体 pBi35STC12， 以期获得抗这 2 种病毒的转基因加工番茄，为加工番茄病毒病的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 毒源、植物、菌株及载体 供试毒源为黄瓜花叶病毒(CMV)分离物 NS0-4 和番茄花叶病毒(ToMV)分离物 SCS-2，均为石河子大学农业生物技术重点实验室保存。供试植物为加工番茄红番3号种子，为市售。菌株为大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，均为石河子大学农业生物技术重点实验室保存。载体为中间载体 piRDG12 和表达载体 pBi35SDG12，均为石河子大学农业生物技术重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂 逆转录酶试剂盒(AMV)、pGEM-T easy、T4DNA连接酶、Plant Genomic DNA Kit 植物基因组 DNA 提取试剂盒、Wizard DNA clean-up kit 凝胶回收试剂盒，均购自 Promega公司；TaqDNA 聚合酶和RNA prep pure plant kit，均购自TIANGEN 公司；限制性内切酶购自 Fermentas 公司；引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.1.3 培养基 1/2MS 液体培养基：1/2MS 大量元素+MS 微量元素+MS 铁盐+MS 有机物质+15 g/L 蔗糖，pH 5.8；分化培养基：MS+6-BA 2 mg/L+IAA 0.1 mg/L+植物凝胶 2 g/L，pH 5.8；共培养基：MS+6-BA 2 mg/L+IAA 0.1 mg/L+AS(乙酰丁香酮)100 μmol/L+植物凝胶 2 g/L，pH 5.8；筛选培养基：MS+ZT 0.5 mg/L+IAA 0.1 mg/L+Carb(羧苄青霉素) 300 mg/L+Kan(卡那霉素) 50 mg/L+植物凝胶2 g/L，pH 5.8；生根培养基：1/2 MS+IAA 0.1 mg/L+Carb 300 mg/L+Kan 50 mg/L+植物凝胶2 g/L，pH 5.8。

1.2 RNAi 载体的构建

1.2.1 毒源活化和总RNA提取 通过机械摩擦的方法，用NS0-4接种西方烟(Nicotianaoccidentalis)，SCS-2接种心叶烟(Nicotianaglutinosa)。 NS0-4 在接种约 20 d 后出现症状，提取西方烟总 RNA1；SCS-2在接种第 3天出现症状后，提取心叶烟总 RNA2。具体操作方法依照 RNA prep pure plant kit说明书进行。

1.2.2 干扰片段的选择 根据 NS0-4 和 SCS-2 基因全序列，利用 Vector NTI 软件进行分析，选取NS0-4 1a复制酶第 1 051-1 350 bp 序列(300 bp)和 SCS-2 130/180 ku复制酶第 1 920-2 200 bp 序列(281 bp)的cDNA 作为干扰片段。

1.2.3 引物设计 根据干扰片段和pBi35SDG12载体Intron序列两端的限制性内切酶位点，设计2对引物,CR12SP：5′-CGGGATCCTGCCCACCCGAACTCATTCGA-3′(BamHⅠ)，CR12ASP：5′-GGGGTACCGCAATATAATGATAATCGTT-AATATCGATGCGTT-3′(KpnⅠ)；To12SP：5′-CGAGCTCGGATCCTGTTGCGCTAGCATTGC-AAGATTCT-3′(SacⅠ+BamHⅠ)，To12ASP：5′-GAAGATCTTAAAGTTTTTCATTTGTTGAA-CTTTAAGAGGGC-3′(BglⅡ)，下划线部分为酶切位点，酶切位点之前的碱基为保护碱基。

1.2.4 干扰片段的RT-PCR扩增 将总RNA1(NS0-4)和总RNA2(SCS-2)根据逆转录酶试剂盒(AMV)说明书分别合成cDNA1 和cDNA2 。以cDNA1为模板，用引物CR12SP和CR12ASP进行PCR扩增，得到1a复制酶第1 051-1 350 bp 316 bp大小的片段CR12；以cDNA2为模板，用引物To12SP和To12ASP进行PCR扩增，得到130/180 ku复制酶第1 920-2 200 bp约302 bp大小的片段To12。PCR产物经10 g/L琼脂糖电泳检测后，将CR12和To12分别克隆到pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌E.coilDH5α，酶切鉴定正确后，重组质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。将构建的载体命名为pGEM-T-CR12和pGEM-T-To12。

1.2.5 干扰片段的拼接 将 pGEM-T-CR12 用BamHⅠ/PstⅠ酶切回收含 CR12 的小片段，pGEM-T-To12 用BglⅡ/PstⅠ酶切回收含 To12 的大片段，然后将回收的大小片段通过同位酶(BamHⅠ/BglⅡ)连接得到pGEM-T-TC12。转化大肠杆菌E.coilDH5α，酶切鉴定正确后，重组质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。干扰片段的拼接流程见图1。

1.2.6 中间载体的构建 用BamHⅠ/KpnⅠ双酶切 pGEM-T-TC12 质粒及piRDG12 载体质粒，回收含 CR12-To12 的正向片段和 piRDG12 载体的相应片段，将它们连接并转化大肠杆菌E.coilDH5α，酶切鉴定正确后，将构建的载体命名为 piRTC12_R。用SpeⅠ/SacⅠ双酶切 pGEM-T-TC12 质粒及 piRTC12_R 质粒，回收含CR12-To12 的反向片段和 piRTC12_R 的相应片段，将它们连接并转化大肠杆菌E.coilDH5α，酶切鉴定正确后，将构建的载体命名为 piRTC12。

1.2.7 RNAi载体的构建 用XbaⅠ/EcoRⅠ双酶切中间载体 piRTC12 及植物表达载体pBi35SDG12，回收目的片段，连接转化到大肠杆菌E.coilDH5α 中，酶切鉴定正确后，将构建正确的 RNAi 载体命名为 pBi35STC12。RNAi 载体的构建见图2。

1.3 加工番茄的遗传转化

将含有 pBi35STC12 质粒 DNA 的农杆菌 GV3101，在200 r/min、28 ℃ 振荡培养 1 d，然后将该菌液以 1∶10 比例扩大，在200 r/min、28 ℃ 振荡培养 6 h后于4 ℃ 、5 000 r/min离心15 min，回收菌体，用 1/2MS 液体培养基稀释到OD600为 0.6～0.8。切取发芽8～10 d的加工番茄幼苗子叶，置于分化培养基上，于 24 ℃ 黑暗条件下预培养3 d后，将子叶置于含菌体的1/2MS 液体培养基中侵染 20 min，捞出后用无菌滤纸吸去多余的农杆菌液，置于共培养基中共培养 2 d 后移至含 300 mg/L Carb(羧苄青霉素)和 50 mg/L Kan(卡那霉素)的筛选培养基上，进行抑菌﹑筛选培养，之后约 2 周左右换 1 次培养基进行继代培养 1 次，直至叶缘产生再生芽；当不定芽长到1.5～2 cm 时，从基部切下，插入生根培养基中诱导生根。待植株长到 6～8 cm 时进行驯化培养，1 周后移栽到盆中。

图1 CMV和ToMV RNA干扰片段的拼接

1.4 转基因加工番茄植株的 PCR 检测

取转基因加工番茄植株叶片，用方宣钧等[17]的方法提取基因组 DNA 进行 PCR 分析。根据拼接的干扰片段序列，采用Primer 软件，设计检测干扰片段正向序列的特异性引物，TC12SP：5′-CGGATCCTGTTGCGCTAGCATTGCAAGATTCT-3′ (BamHⅠ)和 TC12ASP： 5′-GCAATATAATGATAATCGTTAATATCGATGCGTT-3′(下划线部分为酶切位点，酶切位点之前的碱基为保护碱基)，产物大小为 608 bp。PCR 产物用10 g/L琼脂糖电泳检测。

根据pBi35STC12载体的Intron序列和NOS终止子序列，设计检测干扰片段反向序列的特异性引物，SP/In-Nos：ACCCTAAATTTATCAAGACAAGGTT和ASP/In-Nos：AAGACCGGCAACAGGATTC，产物大小为762 bp。PCR产物用10 g/L琼脂糖电泳检测。

2 结果与分析

2.1 CMV和ToMV RNA干扰片段的 RT-PCR 扩增

以 cDNA1 为模板、CR12SP 和 CR12ASP 为引物进行 PCR 扩增，得到1条与预期大小一致的约316 bp 的片段 CR12；以 cDNA2 为模板、To12SP 和 To12ASP 为引物进行 PCR 扩增，得到1条与预期大小一致的约302 bp 的片段 To12 (图3)。将 CR12 和 To12 分别与 pGEM-T easy 连接，得到 pGEM-T-CR12 和 pGEM-T-To12，提取质粒，经酶切鉴定，所得序列正确。

2.2 RNAi 载体 pBi35STC12 的构建及鉴定

2.2.1 干扰片段的拼接 将质粒 pGEM-T-CR12 用BamHⅠ/PstⅠ酶切回收，得到含 CR12 的长约340 bp 的小片段；将 pGEM-T-To12 质粒用BglⅡ/PstⅠ酶切回收，得到含 To12 的长约 3 280 bp 的大片段(图4)。通过同位酶(BamHⅠ/BglⅡ)将回收的片段连接，得到pGEM-T-TC12，提取质粒，经酶切鉴定，所得序列正确(图5)。

图2 CMV 和ToMV RNAi 载体的构建

图3 CMV和ToMV RNA干扰片段的RT-PCR扩增

2.2.2 中间载体 piRTC12 的构建及鉴定 重组质粒 pGEM-T-TC12 用BamHⅠ/KpnⅠ双酶切鉴定正确，回收含 CR12-To12 的长 597 bp 的正向片段； 用SpeⅠ/SacⅠ双酶切重组质粒pGEM-T-TC12 后，回收到含 CR12-To12 的长 597 bp 的反向片段(图5)。将回收的正向和反向片段连接到载体 piRDG12 的相应酶切位点，获得中间载体 piRTC12。经XbaⅠ/EcoR Ⅰ 双酶切鉴定正确(图6)。

2.2.3 pBi35STC12的构建及鉴定 将鉴定正确的中间载体 piRTC12，用XbaⅠ/EcoRⅠ双酶切，回收到长 1 752 bp 的目的片段(图6)，连接到表达载体 pBi35SDG12 的相应位点，得到植物表达载体 pBi35STC12，对其进行XbaⅠ/EcoRⅠ双酶切，获得长1 752 bp 和 9 571 bp 的片段(图7)。

图4 pGEM-T-CR12和pGEM-T-To12干扰片段的融合酶切

图6 中间载体 piRTC12的酶切鉴定

2.3 转基因加工番茄植株的获得

以红番 3 号加工番茄为转化受体，利用农杆菌转化法对 1 500 个外植体进行侵染、转化，然后转入筛选培养基上培养，直至长出愈伤组织、分化出绿芽，待小芽长到 1.5～2 cm 后转入生根培养基。待植株长到 6～8 cm 时进行炼苗，然后再移入盆中，共移栽 33 株，成活了 33 株(图8)。

图8 转基因加工番茄植株的获得

2.4 转基因加工番茄植株的PCR检测

提取转基因加工番茄植株叶片总DNA，分别以 TC12SP、TC12ASP 和 SP/In-Nos、ASP/In-Nos 为引物，通过 PCR 检测干扰片段是否成功导入。PCR 检测结果显示，33 株加工番茄转基因再生植株中有19 株均含正向(图9)和反向干扰片段(图10)，表明干扰片段已经成功整合到加工番茄的基因组中，转化率为 1.26%。

图9 部分转基因加工番茄植株正向干扰片段的PCR鉴定

图10 部分转基因加工番茄植株反向干扰片段的PCR鉴定

3 结论与讨论

近年来，随着 RNAi 技术的快速发展及其工作机理的不断阐明,其在植物基因工程研究方面得到了广泛的应用。但在研究中发现，RNAi 植物表达载体的结构、靶基因序列长度及其在靶基因中的位置,都对 RNAi 的效率和效果产生影响[18]。Wesley等[19]对几种不同的 RNAi 载体构建获得的抑制基因表达转基因植株进行了评价,结果显示，含有2个反向重复序列且中间夹1个内含子所形成的发夹 hpRNA 结构，能显著提高 RNA 沉默效果,且沉默效率平均高达 90% 以上。本研究在2个反向重复序列中间有一段大小约266 bp的 Intron 片段，这种结构保证了干扰片段可以按照完全相反的方向插入到目的载体，并在转化后形成发夹 RNA 结构(hpRNA)。在 RNAi 载体设计中，有关干扰序列长度以及靶标基因片段选择的位置尚存在争议，还有待于进一步深入研究。

目前，农杆菌介导的转化方法已被广泛地应用于烟草﹑棉花﹑番茄等作物上，其转化效果受外植体大小、外植体取材部位及培养基中凝胶种类和培养皿封口膜材料等的影响[20]，且转化效率不高，仅为 1.4%～34%[21-23]。本研究中加工番茄遗传转化率仅为 1.26% ，比已报道的转化率低，这可能与试验中所选取材料的苗龄、外植体的种类和大小、接种方式、不同作物和品种及其基因型有关[24-25]。

本研究成功将含 CMV 和 ToMV 分离物复制酶部分基因的 RNAi 载体 pBi35STC12 转入到加工番茄红番 3 号，经过 PCR 检测获得了19 株转基因加工番茄植株，通过对 CMV 和 ToMV复制酶表达的干扰，影响这 2 种病毒的复制，从而达到抗这2种病毒的效果。至于其干扰效果还有待于进一步的检测验证。

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