血管紧张素Ⅱ受体及其信号转导关键酶在宫颈癌中的表达

于娟 高国兰 余立群▲ 吴乾凤 张菊新

1.中国医科大学航空总医院妇科，北京100012；2.河南省人民医院妇产科，河南郑州450003

血管紧张素Ⅱ受体及其信号转导关键酶在宫颈癌中的表达

于娟1高国兰1余立群1▲吴乾凤1张菊新2

1.中国医科大学航空总医院妇科，北京100012；2.河南省人民医院妇产科，河南郑州450003

目的探讨血管紧张素Ⅱ-1型受体（AT1R）和血管紧张素Ⅱ-2型受体（AT2R）及其信号转导关键酶在宫颈癌中的表达。方法收集2013年3月～2014年2月河南省人民医院及中国医科大学航空总医院手术切除正常宫颈组织47例（对照组）、宫颈上皮内瘤变（CIN）组织36例（CIN组）及65例宫颈癌组织标本（宫颈癌组）。采用实时荧光定量PCR检测AT1R和AT2R mRNA水平；蛋白质印记法检测AT1R和AT2R蛋白表达水平。激活AT1R，测定酪氨酸激酶（PTK）活性；激活AT2R，测定胞浆型磷脂酶A2（cPLA2）活性。结果与对照组比较，CIN组及宫颈癌组AT1R、AT2R的mRNA水平以及蛋白表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。激活AT1R后，CIN组与宫颈癌组的PTK活性与对照组比较均明显升高[（64.00±16.23），（89.00±20.76）比（50.00± 12.16）]，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与CIN组比较，宫颈癌组进一步升高（P＜0.05）。激活AT2R后，CIN组和宫颈癌组的cPLA2活性与对照组比较均明显升高[（137.00±19.72）、（181.00±30.83）比(104.00± 21.46)]，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与CIN组比较，宫颈癌组进一步升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论AT1R、AT2R与宫颈癌的发生发展密切相关，有望成为宫颈癌潜在的诊断和治疗靶点。

血管紧张素Ⅱ-1型受体；血管紧张素Ⅱ-2型受体；宫颈癌；信号转导

宫颈癌是严重威胁女性生命健康的妇科恶性肿瘤之一，发病确切原因目前仍不清楚。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是血管紧张素最重要的组成部分，与血管紧张素Ⅱ-1型受体（AT1R）和血管紧张素Ⅱ-2型受体（AT2R）结合，调节血压和电解质平衡，并且在肿瘤血管生成以及肿瘤细胞的增殖、迁移、浸润中起重要作用。血管紧张素受体（ATR）Ⅱ在宫颈癌细胞的表达及意义并未见系统研究。因此，本研究采用实时荧光定量PCR及蛋白质印记法分别检测不同临床分期的宫颈癌患者癌组织中ATR的表达，探讨ATR与宫颈癌发病的相关性，为找寻宫颈癌的有效治疗方法提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013年3月～2014年2月河南省人民医院及中国医科大学航空总医院手术切除的病变宫颈标本101例。其中宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）36例（CIN组），年龄29～73岁，平均（47.7±11.6）岁；按2003年WHO肿瘤组织学分级标准，CINⅠ10例，CINⅡ14例，CINⅢ12例。宫颈癌65例（宫颈癌组），年龄34～71岁，平均（49.5±10.1）岁，按2009年国际妇产科联盟的临床分期标准，Ⅰ期24例，Ⅱ期27例，Ⅲ期9例，Ⅳ期5例。选取同期因子宫肌瘤行全子宫切除的正常宫颈组织47例作为对照组，年龄42～66岁，平均（46.7±5.9）岁。所有患者均签署知情同意书，且经过医院伦理委员会审查通过。所有患者均未接受化疗、放疗或其他针对肿瘤的治疗，无严重心肺疾病、肝炎及伴发其他脏器恶性肿瘤，临床及病理资料完整。三组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 试剂及药品

Trizol试剂购自于美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒A3500购自美国Promega公司；SYBR荧光实时PCR试剂盒购自日本Katara生物公司；鼠抗人AT1R、鼠抗人AT2R和羊抗鼠IgG-HRP二抗均购自Santa Crus公司。AngⅡ、PDl23319、PTK活性检测试剂盒购自美国Sigma公司，磷脂酶A2（cPLA2）活性检测试剂盒购自美国Cayman公司，氯沙坦购自美国默沙东公司。其他试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量PCR检测AT1R、AT2R mRNA水平提取各组样本采用Trizol法提取总RNA，应用反转录试剂盒（A3500）将总RNA（2 μg）反转录为cDNA（20 μL体系）及实时定量PCR,引物设计见表1。采用Livak等[1]报道的2-ΔΔCt方法计算mRNA表达水平。

表1 引物序列表

1.3.2 Western blot检测AT1R、AT2R蛋白表达组织经处理后，按文献方法裂解组织提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，取100 μg蛋白加入2×十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶加样缓冲液中，100℃加热10 min以使蛋白变性。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离蛋白，再将其转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，根据抗体说明书加入稀释的一抗鼠抗人AT1R、鼠抗人AT2R，4℃孵育8 h，TBST洗膜3次，按1∶2000加入辣根过氧化物酶藕联荧光二抗，室温避光孵育1 h，TBST避光洗膜3次，采用Odyssey 13.0扫描仪对硝酸纤维素膜进行扫描成像，采用Quantity one软件对图像进行面积灰度值计算，以目的条带与内参条带灰度比值做半定量分析。

1.3.3 酪氨酸激酶活性测定取各组组织剪成重约100mg，加入AngⅡ（1×10-8mol/L）、AT2R抑制剂PDl23319（5×10-7mol/L），在持续通入95%O2和5%CO2混合气体的Krebs液中37℃摇床环境温育15 min，严格按照试剂盒操作说明书进行PTK活性测定。每一标本分别测2次，取平均值。

1.3.4 cPLA2活性测定取各组组织剪成重约100 mg，加入AngⅡ、AT1R抑制剂氯沙坦（1×10-7mol/L），在持续通入95%O2和5%CO2混合气体的Krebs液中，37℃摇床环境温育15 min，严格按试剂盒说明书进行cPLA2活性测定。每一标本分别测2次，取其平均值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间比较采用Bonferroni t检验（方差齐）或Dunn＇s多组检验（方差不齐），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组AT1R、AT2R mRNA水平比较

与对照组相比较，CIN组（1.35±0.13）及宫颈癌组（1.74±0.21）AT1R的mRNA水平均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与CIN组相比较宫颈癌组AT1R的mRNA水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比较，CIN组（1.55± 0.19）及宫颈癌组（2.40±0.27）AT2R的mRNA水平均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与CIN组比较，宫颈癌组AT2R mRNA水平均明显升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见图1。

2.2 三组AT1R、AT2R蛋白表达水平比较

图1 三组AT1R、AT2R mRNA水平比较

与对照组AT1R的蛋白表达水平（0.89±0.15）比较，CIN组（1.60±0.22）及宫颈癌组（2.61±0.28）均明显升高，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；与CIN组比较，宫颈癌组AT1R的蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组AT2R的蛋白表达水平（0.71±0.12）比较，CIN组（1.92±0.27）及宫颈癌组（3.42±0.33）均明显升高，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；与CIN组比较，宫颈癌组AT2R的蛋白表达水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2AT1R、AT2R蛋白表达水平比较

2.3 酪氨酸激酶活性

激活AT1R后，CIN组与宫颈癌组的PTK活性与对照组相比均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），与CIN组比较，宫颈癌组进一步升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。激活AT2R后，CIN组与宫颈癌组的cPLA2活性与对照组相比均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），与CIN组比较，宫颈癌组进一步升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 酪氨酸激酶与磷脂酶A2表达水平变化[mmol/（min·mg），x±s]

3 讨论

宫颈癌是严重威胁女性生命健康的妇科恶性肿瘤之一，病死率居女性肿瘤死亡第2位，近年我国女性宫颈癌发病率逐年上升，并且呈年轻化的趋势[2-3]。宫颈癌的发生与许多因素有关，但目前我们对宫颈癌发病的具体分子机制尚缺乏全面和深入的了解。AngⅡ作为一种细胞效应因子，主要通过与其受体结合发挥生物学效应。ATR主要分为AT1R、AT2R两种亚型，AT1R、AT2R均属于G蛋白偶联受体，AT1R与Gq蛋白相偶联，促进细胞增殖、诱导血管内皮生长、促进炎症介质的产生。AngⅡ与AT2R结合具有抑制细胞生长及血管内皮产生、抑制炎症介质的产生，拮抗AT1R的作用[4-5]。

研究表明，ATR参与多种癌症的发生发展，激活AT1R刺激肺癌细胞增殖，抑制癌细胞凋亡。激活AT2R对肺癌、前列腺癌、胰腺癌等具有抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡的作用[6-7]。ATR在正常宫颈组织表达，然而ATR对宫颈癌发生发展的影响尚未见系统研究。本研究结果表明，在由正常宫颈组织向CIN及宫颈癌发展过程中，AT1R和AT2R的mRNA及蛋白表达均逐渐增强。表明ATR可能与宫颈癌的发生发展过程有关。有研究报道在子宫内膜癌及卵巢癌组织中ATR的表达升高[8-9]，与本研究结果一致。表明在宫颈癌的发生发展中，与其他肿瘤一样，ATR与癌细胞的增生增殖、肿瘤血管的形成密切相关。

AT1R与AT2R的信号转导途径不同，目前研究表明AT1R常见有两条信号转导途径，第一条确定的信号转导途径为Gq蛋白激活蛋白磷脂酶进而生成第二信使肌醇磷脂，进一步水解为肌醇三磷酸、二脂酰甘油；第二条信号转导途径为AT1R通过激活酪氨酸激酶，使酪氨酸磷酸化，进而调节细胞外信号调节酶的激活[10]。AT2R的信号转导途径目前仍在研究中，迄今为止尚未定论，其途径主要有AT2R激活PLA2，进而激活花生四烯酸的途径、NO/cGMP参与的途径以及激活蛋白磷酸酶等途径[11]。本研究对AT1R信号转导途径中关键酶PTK及AT2R信号转导途径中关键酶PLA2进行研究发现，激活AT1R后，CIN组与宫颈癌组的PTK活性与对照组相比均明显升高，与CIN组相比宫颈癌组进一步升高。激活AT2R后，CIN组与宫颈癌组的cPLA2活性与对照组相比均明显升高，与CIN组相比宫颈癌组进一步升高。说明在宫颈癌发生发展的过程中，AT1R、AT2R的表达水平增加的同时，其活性也随之增加。有研究表明，激活AT1R后刺激癌细胞增殖，抑制癌细胞凋亡；激活AT2R后抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡。癌细胞的增殖与凋亡是一个动态的过程，只有癌细胞的增殖大于凋亡，肿瘤才表现出高度增长活性[12-15]。如果能利用AT1R、AT2R在宫颈癌中的表达及活性特点，抑制AT1R活性，激活AT2R活性，不失为一种治疗宫颈癌的新方向。

综上所述，在宫颈癌的发生发展中，AT1R、AT2R的表达逐渐增高，活性逐渐增强，抑制AT1R活性，激活AT2R活性，可能为治疗宫颈癌的一种新思路。

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Expressions of AngiotensinⅡreceptor and the key signal transduction enzymes in the cervical cancer

YU Juan1GAO Guolan1YU Liqun1▲WU Qianfeng1ZHANG Juxin2
1.Department of Gynecology,Aviation General Hospital of China Medical University,Beijing100012,China;2.Department of Gynecology and Obstetrics,Henan Provincial People＇s Hospital,He＇nan Province,Zhengzhou450003,China

Objective To investigate the expressions of angiotensinⅡreceptor(ATR)and the key signal transduction enzymes in cervical cancer.Methods Uterine cervical tissue specimens from the patients who treated in the Henan Province People＇s Hospital and Aviation General Hospital of China Medical University from March 2013 to February 2014 were collected.There were 47 cases of normal cervix(control group),36 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CIN group)and 65 cases of cervical cancer(cervical cancer group).The levels of AT1R and AT2R mRNA were detected by real-time quantitative PCR and the protein expressions of AT1R and AT2R were determined by Western blot analysis.The activities of protein tyrosine kinase(PTK)were measured when the AT1R was activated by angiotensinⅡ. The activities of cytosolic phospho1ipase A2(cPLA2)were detected when the AT2R was activated.Results The levels of AT1R and AT2R mRNA in the CIN group and cervical cancer group were significantly increased compared with the control group.The levels of AT1R and AT2R protein expression in the CIN group and cervical cancer group were significantly increased compared with the control group(P＜0.05 or P＜0.01).The activities of PTK were increased significantly in the CIN group and cervical cancer group compared with control group[(64.00±16.23)vs(50.00±12.16),P＜0.05;(89.00±20.76)vs(50.00±12.16),P＜0.01].The activities of cPLA2were increased significantly in the CIN group and cervical cancer group compared with control group[(137.00±19.72)vs(104.00±21.46),(181.00±30.83)vs(104.00± 21.46)],the differences of two were statistically significant(P＜0.05 or P＜0.01),compared with the CIN group,cervical cancer group was further increased,the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion AT1R and AT2R are closely associated with the development of cervical cancer and may become candidate markers for early diagnosis of cervical cancer and new targets for therapy.

AngiotensinⅡtype 1 receptor;AngiotensinⅡtype 2 receptor;Cervical cancer;Signal transduction

R711.74

A

1673-7210（2014）10（b）-0024-04

2014-07-08本文编辑：任念）

▲通讯作者