漆酶/介体体系降解黄麻纤维木质素的研究

张勇兵， 董爱学， 周春晓， 袁久刚， 王 强， 范雪荣， 王 平， 崔 莉

(江南大学 生态纺织教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

黄麻纤维是一种可再生又可降解的天然纤维，有着优良的吸放湿性和透气性，同时，还具有抗静电、抑菌和抗紫外线等保健功能[1， 2]。但是，黄麻纤维中木质素含量高达16%左右，这导致黄麻纤维粗硬，可纺性差，长期以来，黄麻纤维主要用于加工麻袋、麻布等低档产品。为了提高黄麻纤维的可纺性，增加其产品的附加值，必须对其进行脱胶处理。

传统的化学法脱胶使用大量的化学药品，污染严重，同时还存在纤维损伤等缺点。为了解决这些问题，环境友好的酶法脱胶得到了广泛的研究和发展[3, 4]。漆酶是一种木质素降解酶，在氧气存在的条件下能够氧化降解木质素的酚型结构单元[5]。同时，在某些具有传递电子能力的介体的作用下，漆酶对木质素的非酚型结构单元也有较好的降解效果[6]。由于漆酶的这种特性，使其用于麻类纤维的脱胶成为可能。何晓红等人[7]分别使用漆酶、纤维素酶、木聚糖酶及果胶酶对黄麻进行脱胶处理，结果表明漆酶处理是最有效的脱胶方式。颜婷婷[8]研究了漆酶/介体用于红麻纤维的脱胶，结果显示，经漆酶/介体处理6 h后，红麻纤维木质素含量由17.82%下降到7.63%，同时，纤维的断裂强度、结晶度等性能也有不同程度的改善。

目前，漆酶用于黄麻纤维脱胶的研究主要集中在木质素的脱除效果上，关于漆酶脱胶过程中，木质素的结构变化鲜见报道。为了阐明漆酶脱除黄麻纤维木质素的机理，我们从黄麻纤维中提取出木质素，然后用漆酶/介体进行处理，通过GPC、元素分析、酚羟基的测定、红外光谱以及核磁共振氢谱对漆酶/介体处理过程中黄麻纤维木质素的结构变化进行了分析，为漆酶/介体用于黄麻纤维的脱胶提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

黄麻织物(常熟市奥村龙泰织造有限公司)；漆酶(酶活5.43 U/mg，Sigma公司)；2, 2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)(Sigma公司)；二氧六环、吡啶、三氯甲烷、乙醚、乙醇、苯、浓盐酸、冰醋酸、乙酸钠、乙酸酐等(均为国药集团化学试剂有限公司产品，分析纯)。

UV-2802S型紫外/可见分光光度计(美国Unico公司)，Nicolet is10傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司)，Wasters 1515型高效液相色谱仪(美国Wasters公司)，元素分析仪Vario ELⅢ(德国Elementar公司)，全数字化核磁共振仪Bruker Aduance Ⅲ 400MHz(德国Bruker公司)。

1.2 黄麻纤维木质素的提取

黄麻纤维木质素的提取参考Evtuguin等人的方法[9， 10]，并根据现有设备作适当修改。称取30 g黄麻，粉碎至40目后用苯/乙醇(体积比2∶1)溶液抽提7 h，然后风干。将风干后的黄麻置于500 mL的圆底烧瓶中，加入350 mL含0.2 mol/L HCl的二氧六环/水溶液(体积比9∶1)，在90℃下抽提60 min。取出烧瓶冷却至室温，然后抽滤。将抽滤之后的残渣再以上面的条件抽提1次，合并2次的滤液，用旋转蒸发仪在40℃下浓缩至60 mL左右。将浓缩后的滤液加入搅动着的800 mL的冰水中使木质素沉淀出来，沉淀出的木质素再用蒸馏水洗涤2次，然后冷冻干燥，得到粗制的黄麻纤维木质素。

将上述得到的粗黄麻纤维木质素溶于100 mL的吡啶/乙酸/水(体积比9∶1∶4)溶液中，加入120 mL CHCl3萃取，待分层后摇振，再次分层后分离其下层溶有木质素的有机层，剩下的水层再加入70 mL CHCl3萃取，分离有机层后，合并2次萃取的有机层，在旋转蒸发仪中40℃下浓缩至80 mL左右。将浓缩液加入500 mL搅动着的乙醚中使木质素沉淀出来，沉淀出的木质素再用乙醚洗涤至无吡啶气味，真空干燥后得到提纯的黄麻纤维木质素。

1.3 漆酶/介体体系(LMS)处理黄麻纤维木质素

称取0.45 g提纯后的黄麻纤维木质素于250 mL的烧杯中，加入50 mL、pH值6的醋酸/醋酸钠缓冲液，再加入50 U/g漆酶和0.5%(相对于木质素)ABTS，在25℃下反应6 h。反应完毕后，将反应液离心，沉淀经多次水洗离心后，冷冻干燥，得到LMS处理后的黄麻纤维木质素。

1.4 黄麻纤维木质素的乙酰化

参考相关文献对黄麻纤维木质素进行乙酰化处理[10]。分别称取黄麻纤维木质素对照样(未处理样)和LMS处理样100 mg于2个棕色试剂瓶中，各加入10 mL吡啶/乙酸酐(体积比1∶2)混合液，盖紧瓶盖，置于暗处72 h，其间经常摇动以利于反应均匀。待反应完成后，将瓶中溶液慢慢滴入搅动着的200 mL乙醚中，沉淀出乙酰化的木质素，用乙醚洗涤至无吡啶气味，真空干燥后得到乙酰化的黄麻纤维木质素。

经乙酰化处理的黄麻纤维木质素，分子结构中的羟基会转变成为乙酰基，质子数增加，以增强1H-NMR的信号强度。

1.5 黄麻纤维木质素分子量的测定

将一定量黄麻纤维木质素溶于N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中，用Waters 1515型凝胶渗透色谱仪测定其分子量及分布，色谱柱为Shodex KD-802柱，检测器为Waters 2414示差折光检测器，柱温35℃，流动相为DMF，流速1.5 mL/min，以聚苯乙烯为标准样。

1.6 元素分析

黄麻纤维木质素中C、H、N元素的含量用德国Vario ZLⅢ Elementar元素分析仪测定，O元素含量根据C、H、N元素的含量计算差值得到。

1.7 酚羟基含量的测定

采用紫外差示光谱法测定酚羟基含量[11]。取2.5 mg黄麻纤维木质素于50 mL容量瓶中，以乙二醇单甲醚为溶剂，使其全部溶解，测定溶液在300 nm的吸光度，酚羟基含量按下式计算：

酚羟基(%)=黄麻纤维木质素单位浓度的吸光度(L/g)×0.414(g/L)

1.8 红外光谱分析

将2 mg黄麻纤维木质素和200 mg KBr在干燥条件下混合均匀后研磨、压片，在Nicolet is10傅里叶变换红外光谱仪上进行测试。

1.9 核磁共振氢谱分析

将一定量乙酰化的黄麻纤维木质素溶于氘代氯仿(CDCl3)中，用Bruker Aduance Ⅲ 400 MHz核磁共振仪进行1H-NMR测定。

2 结果与讨论

2.1 漆酶/介体处理后黄麻纤维木质素分子量的变化

图1 黄麻纤维木质素凝胶色谱图Fig 1 GPC of jute fiber lignins

由表1中的数据可知，经LMS处理后，黄麻纤维木质素的重均分子量从39105降低到31270，数均分子量从25059降低到23407，这表明黄麻纤维木质素在LMS处理过程中发生了降解反应。同时，黄麻纤维木质素的多分散系数也从1.561降低到1.336，这说明经LMS处理后，黄麻纤维木质素中分子质量大的部分所占比例减少，分子量分布更均一。

2.2 元素分析

表2列出了黄麻纤维木质素对照样和LMS处理样的C、H、O元素含量、甲氧基含量和C9单元经验式，其中甲氧基的含量通过1H-NMR推算得到，C9单元经验式根据C、H、O元素含量及甲氧基含量计算得到[12]。

表2 黄麻纤维木质素元素含量、甲氧基含量及C9经验式

由表2可知，与对照样相比，LMS处理样中H元素百分含量降低，而氧元素百分含量升高，这可能是黄麻纤维木质素在LMS处理过程中，发生了氧化反应所致。甲氧基是木质素结构的一个重要特征，经LMS处理后，黄麻纤维木质素中的甲氧基含量由18.05%降低至16.83%，说明在LMS处理过程中，黄麻纤维木质素发生了脱甲氧基反应。

2.3 漆酶/介体处理后黄麻纤维木质素酚羟基含量的变化

根据黄麻纤维木质素在300 nm处的吸光度，计算出木质素中酚羟基的含量，结果见表3。由结果可知，经LMS处理后，黄麻纤维木质素中酚羟基含量降低，这表明在LMS氧化降解黄麻纤维木质素过程中，酚羟基参与了反应。

表3 黄麻纤维木质素酚羟基含量

2.4 黄麻纤维木质素的红外光谱分析

黄麻纤维木质素对照样、LMS处理样的红外光谱图见图2。红外光谱用于定量分析木质素的某些官能团时，通常采用基线法。由于1506 cm-1附近苯环骨架的伸缩振动吸收峰比较稳定，是木质素红外光谱的特征吸收，通常以此峰作为基准数，其他峰的透过率与之对比，即得出该吸收峰的相对透过率。黄麻纤维木质素经LMS处理前后主要吸收峰及相对透过率见表4。

图2 黄麻纤维木质素红外光谱图

/cm-1LMS3443171715061423O-HC=O,C-H0.541.501.001.030.601.371.001.10

从表4中可看出，3443 cm-1处为木质素中羟基伸缩振动吸收峰，经LMS处理后，该吸收峰相对透过率增大，表明LMS处理后木质素中羟基含量有所减少。1717 cm-1处的吸收峰来自木质素中非共轭羰基伸缩振动，经LMS处理后，其相对透过率降低，说明在LMS处理过程中，黄麻纤维木质素发生了氧化反应，生成了新的羰基。1423 cm-1处吸收峰是由木质素中甲氧基C-H振动引起的，经LMS处理后，其相对透过率增大，说明LMS处理引起了黄麻纤维木质素中甲氧基的脱除，这与前面元素分析的结果一致。

2.5 黄麻纤维木质素的核磁共振氢谱分析

经乙酰化处理的黄麻纤维木质素对照样和LMS处理样的1H-NMR谱图如图3所示。参考相关文献[13， 14]，将谱图进行了范围区分，并确定了每个区域对应的质子归属。通过计算各区段信号积分面积与总积分面积的比例，可以得到木质素各官能团的相对质子百分比，再根据元素分析结果计算出每C9单元的总质子数，从而求出各特定区段的质子数，计算结果见表5。

图3 黄麻纤维木质素的1H-NMR谱图Fig 3 1H NMR spectra of jute fiber lignins

根据表5中的数据推算出黄麻纤维木质素每C9结构单元中醇羟基、酚羟基及总羟基的个数，结果如表6所示。

表6 黄麻纤维木质素功能基团含量

由表6可以看出，经LMS处理后，黄麻纤维木质素每C9单元中酚羟基个数、醇羟基个数及总羟基个数均减少。酚羟基含量减少，这与紫外光谱测定的结果一致；醇羟基含量减少，这可能是因为漆酶在介体的作用下能够氧化木质素中的醇羟基；总羟基含量减少，这和前面红外光谱分析结果一致。

3 结论

1)黄麻纤维木质素经LMS处理后，其重均分子量、数均分子量以及多分散系数均降低，表明黄麻纤维木质素经LMS处理后发生降解反应，分子量的分布更均一。

2)黄麻纤维木质素经LMS处理后，酚羟基、醇羟基以及甲氧基含量减少，羰基含量增加。甲氧基含量减少表明在LMS作用下，部分甲氧基发生了脱甲氧基反应，而羰基含量增加可能是LMS处理使黄麻纤维木质素发生氧化所致。

参考文献：

[1]徐旭峰, 陈 鹏, 陈创鑫, 等. 微波强化碱处理黄麻快速脱胶工艺研究[J]. 上海纺织科技, 2010, 38(12):26-28, 31.

[2]付书玉, 俞建勇, 吴丽莉, 等. 黄麻纤维高温脱胶工艺初探[J]. 纺织科技进展, 2008, 30(1):73-75.

[3]杜兆芳, 曹建飞, 方木胜. 黄麻酶脱胶工艺研究[J]. 安徽农业大学学报, 2005, 32(1):98-100.

[4]马洪雨, 王占奎, 俞 阗, 等. 黄麻生物脱胶研究进展[J]. 湖南农业科学， 2009(11):11-14.

[5]Eggert C, Temp U, Dean J F D, et al. A fungal metabolite mediates degradation of non-phenolic lignin structures and synthetic lignin by laccase[J]. FEBS Letters, 1996, 391(1-2):144-148.

[6]Bourbonnais R, Paice M G. Demethylation and delignification of kraft pulp byTrametesversicolorlaccase in the presence of 2, 2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 1992, 36(6):823-827.

[7]何晓红, 俞建勇, 刘丽芳. 不同生物酶处理对黄麻纤维的影响[J]. 纺织科技进展, 2008, 30(6):73-75.

[8]颜婷婷. 黄、红麻纤维的木质素结构及其脱胶研究[D]. 上海:东华大学, 2011.

[9]Evtuguin D V, Neto C P, Silva A M S, et al. Comprehensive study on the chemical structure of dioxane lignin from plantation eucalyptus globulus wood[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(9):4252-4261.

[10]高 慧, 詹怀宇, 付时雨, 等. 马尾松正常木与应压木木素结构的比较[J]. 林业科学, 2010, 46(5):141-146.

[11]徐清华, 秦梦华, 傅英娟, 等. 旧报纸漆酶/介体脱墨过程中木质素结构的研究[J]. 中国造纸学报, 2006, 21(2):26-30.

[12]李友明, 陈中豪. 木素苯基丙烷结构单元经典式的表达与计算[J]. 中国造纸学报, 1999, 14(1):98-100.

[13]Sarwar J M, Mun S P. Isolation and characterization of lignin from tropical and temperate hardwood[J]. Bangladesh Journal of Scientific and Industrial Research, 2009, 44(3):271-280.

[14]Yan T T, Xu Y Q, Yu C W. The isolation and characterization of lignin of kenaf fiber[J]. Journal of Applied Polymer Science, 2009, 114(3):1896-1901.