PDX-1腺病毒载体构建及其在脂肪间充质干细胞中的表达

王晓囡, 周 艳, 严 敏, 鲁帅尧, 李 松, 孙茂盛, 李鸿钧

(中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所；云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心；云南省重大传染病疫苗研发实验室, 昆明 650118)

胰岛β细胞分化发育过程中，转录因子与信号通路的调控机制非常复杂，多种转录因子的时序表达，决定着胰腺的分化与发育进程[1]。胰芽形成之初，反式作用因子胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pancreatic duodenal homeobox 1, PDX-1)能够启动前体细胞向胰腺细胞包括所有外分泌与内分泌细胞分化[2， 3]，而进一步向内分泌细胞分化则需要神经元素3(Neurogenin 3, NGN3)、成对盒基因4 (paired box gene 4, PAX4)、NK6转录因子相关1 (NK6 transcription factor related, locus 1, NKX6. 1)等多种转录因子协同作用[4]。近年研究证明，PDX-1基因的活化及相关信号通路的启动能够使间充质干细胞向胰腺β细胞方向分化，说明PDX-1基因在胰腺分化调控过程中起着“总开关”的作用[5, 6]。脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells， s)在体内含量丰富，易于获得，且可自体移植，在血糖平衡及激素产生方面也具有重要作用[7]，成为干细胞治疗糖尿病的较为理想的干细胞资源。因此，构建PDX-1腺病毒表达载体，以PDX-1腺病毒感染脂肪间充质干细胞，对其进行重编程，以探索PDX-1在脂肪间充质干细胞中的表达情况，为进一步研究ASCs向胰岛β细胞分化过程中的作用与机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

SalⅠ、NotⅠ、PacⅠ等多种限制性内切酶，T4 DNA ligase，PrimeSTAR HS DNA Polymerase，Lipofectamine 2000脂质体均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自OMEGA公司。兔抗大鼠PDX-1IgG购自Cell signal公司。 Adenoviral vector system购自美国Strategen公司。引物由上海丰科生物有限公司合成。L-DMEM培养基购自Hyclone。吲哚美辛(indomethacin)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)、油红O(Oil Red-O)、β-甘油磷酸钠(β-Glycero-phosphate disodium salt hydrate)、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐(L-Ascorbic acid-2-phosphate)购自Sigma-Aldrich公司；细胞碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒购自GENMED Scientifics 公司。RIPA蛋白裂解液购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1PDX-1基因的PCR扩增

以南京金斯瑞公司构建的pUC57-PDX-1(PDX1 NM_022852.3)质粒为模板，分别以P1，P2为引物，见表1，PCR扩增PDX-1基因，PCR反应体系为50 μL，2×PrimeSTAR GC buffer 25 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 4 μL，P1(10 μmol/L) 1 μL，P2(10 μmol/L) 1 μL，pUC57-PDX-1质粒1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL) 0.5 μL，dH2O补足50 μL。反应条件为98℃ 10 s；56℃ 5 s；72℃ 1 min，35 cycle。扩增产物在质量分数为1%琼脂糖凝胶中电泳。

表1 PCR所用引物

1.2.2 穿梭质粒pShuttle-CMV-PDX-1的构建

PDX-1的PCR产物经过胶回收纯化后与pShuttle-CMV质粒同时用SalⅠ和NotⅠ双酶切，分别胶回收852 bp PDX-1基因片段与7500 bp载体片段，T4DNA连接酶连接两个目的片段，连接产物转化DH5α感受态，筛选并扩增pShuttle-CMV-PDX-1质粒的DH5α，抽提质粒pShuttle-CMV-PDX-1。

1.2.3 pAdEasy-CMV-PDX-1腺病毒载体的构建

1)PmeⅠ酶切线性化pShuttle-CMV-PDX-1，胶回收纯化，并做CIAP去磷酸化处理。2)去磷酸化产物用PCR纯化试剂盒进行纯化。3)将线性化质粒pShuttle-CMV-PDX-1和pAdEasy-1质粒共同加入电转化BJ5183感受态细胞，冰浴30 min。4)将冰浴后的全部质粒菌体混合物转移至间距为2 mm的BioRad电转杯中，电压2.5 kV，电阻200 Ω，电容25 μF电转。5)电转结束后，加入800 μL LB培养基重悬菌体，37℃水浴45 min。6)将菌液涂布到含卡那霉素的LB琼脂板上，37℃倒置培养过夜。7)筛选带有pAdEasy-CMV-PDX-1病毒质粒的BJ5183，提取pAdEasy-CMV-PDX-1质粒。8)pAdEasy-CMV-PDX-1转化XL-10感受态细胞，大量提取pAdEasy-CMV-PDX-1，对产物进行酶切及测序鉴定。

1.2.4 重组腺病毒Ad-PDX-1的包装、扩增和滴度测定

HEK293细胞在含有体积分数为10% FBS，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素的H-DMEM培养液中于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。待单层贴壁细胞贴壁率接近80%时，PacⅠ酶切线性化pAdEasy-CMV-PDX-1质粒，用Lipof-ectamine2000脂质体转染HEK293细胞。7～10 d后，大部分细胞病变并脱落时收毒，反复冻融3次，8000 r/min, 离心10 min，收集上清，再用收集的病毒液感染HEK293细胞大量扩增病毒。用Reed-Muench法测定重组腺病毒的感染性滴度。

1.2.5 重组腺病毒Ad-PDX-1的形态学观察

取5 μL 扩增所得的重组腺病毒滴至腊盘上，将铜网盖在病毒液上进行吸附，铜网用重金属盐(磷钨酸)进行负染，吸走多余染料，等样品干燥后将铜网置于透射电镜下观察。

1500 r/min离心10 min收集感染重组腺病毒24 h、48 h和72 h的HEK293 细胞，置于2.5%戊二醛(0.2 mol/L 二甲胂酸钠缓冲液配制)中固定2 h；经二甲胂酸钠缓冲液漂洗3～5次；再将样品置于1%四氧化锇(锇酸)溶液(0.2 mol/L 二甲胂酸钠缓冲液配制)固定2 h；用二甲胂酸钠缓冲液漂洗3～5次，置于缓冲液中过夜；将样品依次放入30%、50%、70%、90%及100%丙酮中进行脱水处理，每次10 min；配制环氧树脂618，按比例与丙酮混合配制；然后将样品依次放入环氧树脂与丙酮1∶2、1∶1 溶液及纯环氧树脂中进行浸透处理，每次2 h；将处理后的样品放入模具，加入环氧树脂，置于温箱，40℃处理12～20 h，再经60℃处理48～60 h进行包埋；取出包埋块，进行修块、切片处理；将超薄切片进行染色处理：2%醋酸铀染色30 min，蒸馏水冲洗；枸橼酸铅染色液染色30 min，蒸馏水冲洗；完成后静置待切片干燥；最后经透射电子显微镜观察。

1.2.6 脂肪间充质干细胞的分离培养[8]

手术剪和镊子用0.1%新洁尔灭浸泡消毒，大鼠断颈处死后，在75%酒精中浸泡3 min, 无菌条件下取大鼠蹊部脂肪组织，在加有双抗的PBS中洗3次以去除残余的血迹，分离可见的血管和纤维成分，将组织剪碎后，加入与脂肪组织等体积的0.1%的Ⅰ型胶原酶，37℃消化40～60 min, 加入与Ⅰ型胶原酶等体积的含10%胎牛血清的L-DMEM培养基终止消化，过滤，1600 r/min离心8 min，弃上清，加入适量L-DMEM培养基(含15% 胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素)，以1×106接种于T-25培养瓶中，置37℃，5% CO2细胞培养箱中培养，4 d后换液。

待单层贴壁细胞贴壁率接近90%时，体积分数为0.25%胰蛋白酶-4%EDTA消化细胞，按1∶2的比例传代培养。每3～4 d传代1次。

1.2.7 rASCs多向分化潜能鉴定[9]

1)成脂诱导。rASCs贴壁率接近90%时，按照图1所示流程，诱导21 d后，弃去培养液，细胞经PBS洗涤后，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS 洗涤细胞2 次，3%油红O工作液避光染色30 min，PBS 洗涤，于光学显微镜下直接观察。

图1 rASCs成脂诱导流程

2)成骨诱导。rASCs贴壁率接近70%后，加入成骨诱导培养液(含有10% 胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素+10 nmol/L地塞米松+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠+150 μmol/L L-抗坏血酸的DMEM/F12)。以后每4 d按以上配方换1次溶液。成骨诱导至第21 d后，使用ALP检测试剂盒对诱导细胞进行碱性磷酸酶活性鉴定。

1.2.8 Ad-PDX-1感染rASCs及PDX-1在细胞中的表达

按 2.0×106/孔的接种密度将rASCs接种于六孔培养板，当细胞汇合达到80%时，按照MOI=5.0加入相应量的Ad-PDX-1病毒液，同时设立无腺病毒感染的ASCs对照组。48 h后，分别以P1，P2为引物，RT-PCR方法检测目的基因PDX-1在rASCs中的转录情况，先用RNA快速提取试剂盒提取实验组及对照组细胞总RNA，反转录合成cDNA, 再以cDNA为模板做PCR，反应体系及条件如1.2.1中所述。同时，以免疫荧光法及Western blotting检测PDX-1目的蛋白在rASCs中的表达情况。另外，检测病毒感染rASCs 21 d时的表达情况，以验证病毒在细胞中的持续表达能力。

1)免疫荧光检测。分别将实验组及对照组细胞爬片，先用PBS洗2次，再用-20℃预冷的纯甲醇于4℃固定10 min, PBS洗3次，2% BSA 37℃封闭30 min，加入兔抗大鼠PDX-1一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3次，FITC标记的羊抗兔二抗37℃孵育1 h，PBS洗3次，取出细胞爬片，滴加甘油封片，荧光显微镜下于激发波长488 nm，放大倍数200倍下观察结果。

2)Western Blotting检测。用RIPA裂解实验组及对照组细胞获得细胞蛋白液，取50 μL蛋白液与10 μL 5×上样缓冲液混合，100℃变性10 min，12% SDS-PAGE胶电泳分离，电转移至0.22 μm孔径的硝酸纤维素膜，在体积分数为5%脱脂奶粉/TBST的封闭液中，室温封闭1 h，TBST漂洗3次，加入兔抗大鼠PDX-1一抗，4℃振荡过夜。TBST漂洗3次，每次15 min, 加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温振荡1 h后TBST漂洗3次，化学显色。β-actin做内参。

2 结果

2.1 PCR获取大鼠PDX-1基因

以pUC57-PDX-1质粒为模板，以P1，P2为引物，PCR特异性扩增大鼠PDX-1基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示大小约为852 bp的特异性条带，该条带为PDX-1基因的特异扩增产物(见图2)。

M—DL1000 DNA Maker； 1—大鼠PDX-1基因。

2.2 酶切鉴定重组腺病毒质粒

SalⅠ与NotⅠ双酶切pShuttle-CMV-PDX-1，阳性克隆产物为2条带，大小分别为7500 bp、852 bp，见图3A。pAdEasy-CMV-PDX-1用PacⅠ酶切，阳性克隆产物为2条带，且小片段长度为3.0 kb或4.5 kb，本实验筛选出的是4.5 kb的阳性克隆，见图3B。所有酶切结果均与理论预期一致，表明PDX-1序列已成功插入pAdEasy-1载体中，且连接正确。

M—DL10000 DNA Maker；A—SalⅠ和NotⅠ双酶切pShuttle-CMV-PDX-1结果；B—PacⅠ酶切pAdEasy-CMV-PDX-1结果。

图3构建的相关载体酶切鉴定结果

Fig 3 The results of enzyme cutting related vectors

2.3 腺病毒Ad-PDX-1的形态学观察及滴度测定

PacⅠ酶切线性化pAdEasy-CMV-PDX-1质粒，用Lipofectamine2000脂质体转染HEK293细胞，7～10 d后，细胞聚集、细胞间隙增大、变圆、呈葡萄状，见图4。待大部分细胞病变后，反复冻融3次，收集病毒液。透射电镜观察复染的病毒颗粒，形态正常，直径约为70～90 nm, 符合典型的腺病毒的20面体对称结构，见图5。重组腺病毒感染HEK293细胞24 h, 48 h及72 h后，细胞超薄切片结果表明，病毒感染后细胞形态开始变圆、皱缩、呈现不规则形，细胞核较小，在细胞中分布有较多的腺病毒颗粒，并且随着感染时间的增加，胞质中的腺病毒颗粒也变多，见图6。在重复扩增，收集病毒后，用Reed-Munench法测定重组腺病毒Ad-PDX-1的感染性滴度为107CCID50/mL, 见图7。

A、B、C分别为转染7 d、9 d、10 d时的细胞形态。

图5 透射电镜观察重组腺病毒负染结果

A、B、C分别为腺病毒感染HEK293细胞24 h、48 h、72 h后细胞超薄切片结果。

图6重组腺病毒感染HEK293细胞后超微结构观察

Fig 6 Ultrastructural characteristics of HEK293 cells which were transfected by recombinant adenovirus after 24 hours

2.4 多向分化潜能鉴定结果

经成脂诱导后的rASCs，形态由长梭形逐渐变圆，呈短圆梭形、椭圆形。诱导8 d后，在光镜下可以看见折光性强的空泡提示脂滴开始形成，见图8A。诱导21 d后的细胞经油红O 染色，可见胞浆内有大量被染成红色的脂滴，见图8B，对照细胞始终未见被染色脂滴，见图8C，说明rASCs在体外具有向脂肪细胞分化的潜能。

图7 病毒滴度测定结果

图8 rASCs的成脂诱导分化

经成骨诱导后的rASCs，细胞出现聚集生长的倾向，呈多层网状生长，见图9A。诱导21 d后，对细胞进行碱性磷酸酶(ALP)染色，ALP是成骨细胞分化的代表性酶，ALP 作为成骨细胞表型特征之一，在体外钙化中起关键性作用，随其升高的同时出现大量钙盐的沉积，ALP 活性越高，说明细胞向成骨细胞分化越明显，实验中诱导后细胞可以看见胞浆被染成蓝黑色，见图9B，对照组细胞中则无明显着色，见图9C。说明rASCs在体外具有向成骨细胞分化的潜能。

图9 rASCs的成骨诱导分化

2.5 Ad-PDX-1感染rASCs后，PDX-1的表达情况

感染Ad-PDX-1的rASCs在48 h后可检测到PDX-1基因的转录，而对照组则无PDX-1基因的转录(图10)。免疫荧光法和Western blotting法均检测到实验组rASCs中转录因子PDX-1的高表达，而在对照组中则检测不到其表达(图11和图12)。且病毒感染rASCs 21 d后，仍能检测到PDX-1的转录与表达。

M—DL1000 DNA Maker; 1、3、5—分别为内参β-Actin 的转录情况； 2、4—分别为Ad-PDX-1感染rASCs 48 h、21 d后，PDX-1转录情况； 6—rASCs对照组PDX-1转录情况。

图10 PDX-1在实验组及对照组中的转录情况

Fig 10 The transcription of PDX-1 in the experimental group and the control group

A1A2—Ad-PDX-1感染rASCs 48 h后，PDX-1表达情况(200×) ；B1B2—rASCs对照组PDX-1表达情况(200×)。

图11免疫荧光法检测PDX-1的表达情况

Fig 11 The expression of PDX-1 protein detected by immunofluorescence

1—rASCs对照组; 2—Ad-PDX-1感染rASCs 21 d; 3—Ad-PDX-1感染rASCs 48 h。

图12 Wsetern blotting法检测PDX-1的表达情况

Fig 12 The expression of PDX-1 protein detected by Wsetern blotting

3 讨论

脂肪间充质干细胞因含量丰富，易于分离，因而受到广泛关注[10]。本研究通过I型胶原酶消化法，连续传数代后，可成功从脂肪中获取高纯度的rASCs。rASCs的基本特征为：贴壁生长，细胞呈纤维状，旋涡排列。细胞多向分化潜能鉴定表明，rASCs可以分化为脂肪细胞和成骨细胞，这一结果证实了其具有较强的可塑性和多向分化潜能，符合间充质干细胞的基本特征。

近年研究发现ASCs不仅具有多向分化潜能，在血糖平衡及激素产生方面也具有重要作用[7]，在治疗糖尿病方面的研究也越来越多。腺病毒因其基因组重排频率低，安全性较好，插入大片段外源性基因的潜力大，有较大的宿主范围，外源基因表达水平较高等优点[11]倍受研究者喜爱。本研究选用的腺病毒载体为人腺病毒5型，即复制缺陷型腺病毒。首先我们将PDX-1基因片段插入到pShuttle-CMV载体中，通过同源重组的方法，获得了pAdEasy-PDX-1重组腺病毒质粒。酶切鉴定与测序结果显示目的基因片段PDX-1成功克隆至载体的多克隆位点。脂质体法转染HEK293细胞，转染7 d细胞开始变圆，聚集，呈葡萄状，即出现典型的细胞病变效应。病毒复染后电镜观察，可见直径约为70～90 nm, 呈20面体对称结构的病毒颗粒，符合典型的腺病毒特征。病毒感染HEK293细胞后，分时间段收集细胞，细胞超薄切片表明包装获得的腺病毒颗粒在HEK293细胞中成功扩增。连续传代3到4次，获得大量具有稳定感染性的重组腺病毒Ad-PDX-1，传至第3代，病毒滴度达107CCID50/mL，已满足本实验需要。

酶切鉴定结果及测序结果均表明，该重组腺病毒载体含有PDX-1基因片段，且插入顺序完全正确。为进一步研究重组腺病毒Ad-PDX-1对rASCs的感染效率及目的基因在rASCs内的表达情况，用Ad-PDX-1感染rASC 48 h后，通过RT-PCR、免疫荧光、Western blotting等证实，Ad-PDX-1对rASCs具有很高的感染能力，当细胞的病毒感染复数(MOI)为5.0时，有90%以上的细胞被感染，说明Ad-PDX-1对rASCs具有较强的感染能力。免疫荧光结果证实，PDX-1目的产物能特异定位于细胞核内，说明所构建的腺病毒Ad-PDX-1表达的目的基因PDX-1具有核定位等转录因子共有的基本生物活性。RT-PCR及Western blotting结果表明，Ad-PDX-1感染rASCs 21 d后仍能检测到PDX-1的转录及表达，为后续将大鼠脂肪间充质干细胞向胰岛β细胞诱导分化奠定了基础，为糖尿病的干细胞治疗提供依据。

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