三种鳜鱼骨骼肌生长及相关调控基因表达比较

许淼洋赵金良李传阳钱叶周吴超钱德

（1. 上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；2. 池州市秋浦特种水产开发有限公司，池州 247104）

三种鳜鱼骨骼肌生长及相关调控基因表达比较

许淼洋1赵金良1李传阳1钱叶周2吴超2钱德2

（1. 上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；2. 池州市秋浦特种水产开发有限公司，池州 247104）

通过制作骨骼肌石蜡切片研究了鳜、斑鳜及斑鳜（♀）×鳜（♂）杂交一代不同发育时期（孵化后10D、20D、30D、60D、90D）骨骼肌肌纤维的生长特征，同时，利用qPCR技术分析了肌肉中myostatin、MyoD、myogenin三个基因mRNA的表达变化。结果表明，3种鳜鱼全长均随日龄呈增大趋势，种间生长差异显著，鳜生长最快，斑鳜最慢，杂交一代介于斑鳜和鳜之间。不同发育时期，3种鳜鱼骨骼肌肌纤维数目较为接近，增生生长种间无明显差异，而肌纤维平均直径大小与其生长快慢间呈正相关，表明不同鳜鱼种间生长差异主要由肌肉肥大生长引起的。鳜、斑鳜和杂交一代 myostatin mRNA在D20出现表达高峰，之后表达量呈下降趋势。MyoD在D10、D20表达水平较高，后期表达水平下降；Myogenin在D20时表达量最低，之后，鳜表达量升高最为明显，杂交一代次之，斑鳜保持平稳。不同种类鳜鱼肌肉生长差异与3种基因表达差异间存在一定相关性。

鳜鱼 生长 肌纤维 myostatin MyoD myogenin mRNA表达量

鳜（Siniperca chautsi）和斑鳜（S. scherzeri）是我国特有的名贵淡水经济鱼类。鳜是目前鳜鱼养殖的主要品种，生长速度快，专以活饵为食，但抗病性差［1，2］。斑鳜经驯化可食鲜饵，病害少，但生长速度较慢［3］。杂交是水产育种的重要手段［4］，不仅能丰富遗传结构，结合不同类型亲本的优良性状，提高杂种的养殖性能，而且能产生超亲优良性状，获得杂种优势［5］，在鱼类品种改良中发挥明显作用。

为获得生长快、可食鲜饵，养殖性能更为优良的鳜鱼新品种，我们利用种间杂交技术获得了斑鳜（）×鳜（♂）杂交一代，网箱养殖试验中，杂交后代养殖成活率高，生长性能较斑鳜明显提高，且饵料系数明显降低［6］，表现出良好的养殖效果和生产潜力。

在大多数鱼类中，个体体重的40%-60%是骨骼肌［7］，骨骼肌主要由可供食用的白肌构成［8］。骨骼肌生长主要依靠肌纤维增生（hyperplasia，即数目增加）和肥大（hypertrophy，即尺寸增大）［9］。对于终生生长的鱼类来说，性成熟后肌纤维仍可发生增生和肥大生长，不同发育阶段肌纤维增生和肥大生长所占的比重也不相同［10］。

肌细胞的分化和生长由正向调控因子和负向调控因子进行双向调节。其中，正调控因子主要有生肌调节因子家族（MRFS）、肌细胞增强因子2（MEF2）、胰岛素样生长因子（IGFs）等，负调控因子有分化抑制因子（Id）、肌肉生长抑制素（myostatin）、原癌基因等［8］。生肌调节因子家族在骨骼肌细胞的特化和分化过程中起关键作用［11］，该家族包括4个基因：MyoD、Myf5、myogenin（MyoG）、MRF4［12］。MyoD与成肌细胞增殖和肌肉增生有关，能促进多种类型细胞转化为成肌细胞，并促使成肌细胞进一步融合、分化为成熟的肌纤维［13］。Myogenin与成肌细胞的分化和肌肉肥大相关，抑制成肌细胞的增殖，并调节单核的成肌细胞分化成多核的肌纤维［14］。Myostatin属于转化生长因子超家族，是一类重要的肌细胞生长调控因子，通过抑制生肌调节因子家族成员转录活性负向控制肌细胞的生长发育［15］。大量研究证明，myostatin是影响动物骨骼肌生长发育的重要候选基因［16］。

为深入了解不同鳜鱼种类间的生长发育差异，本研究比较了鳜、斑鳜及其杂交一代孵化后90 d内的骨骼肌生长特性，以及肌肉生长发育调控基因myostatin、MyoD、myogenin相对表达差异，以期为鳜鱼杂交育种及鱼类肌肉生长机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验在安徽省池州市秋浦特种水产开发有限公司养殖基地进行。挑选性腺成熟的斑鳜（0.5-1.1 kg）、鳜（2.3-3.8 kg），于2013年4月18日注射催产剂（促排卵素2号LRH-A2和马来酸地欧酮DOM），采用人工授精方法获得鳜、斑鳜和斑鳜（♀）×鳜（♂）杂交子一代受精卵。受精卵分别在四大家鱼孵化环道内流水孵化，水温18-25℃，出膜后1周，分别转入水泥池中培育，自开口摄食起，每天定时投喂相同的足量适口活饵料鱼。出膜当天记为第0 d（D0），分别在出膜后第10 d（D10）、20 d（D20）、30 d（D30）、60 d（D60），90 d（D90）取样，每批每种鱼随机取20尾，测量全长。另取10尾，取全鱼或背鳍起点下背侧肌肉，波恩氏液固定；同时，取相同材料于-80℃低温冰箱保存。3种鳜鱼D10、D20、D30样本去除头、尾后保存，D60、D90样本去除鳞片后分别采集背鳍起点下背侧第一肌节区域。

1.2 方法

1.2.1 肌肉组织切片观察 由于骨骼肌在体轴前后、背腹不同区段间存在差异，统一选取背鳍起点下左背侧第一肌节进行切片制作与观察。取波恩氏液固定样品，经酒精脱水、二甲苯透明、石蜡透蜡、包埋、修块，使用徕卡组织薄片切片机（Leica RM 2016）连续横切，切片厚度为4-6 μm。37℃干燥后进行H.E染色，中性树胶封片。在显微镜（Nikon Eclipse 80i）下观察，使用NIS-Elements F软件进行分析。

1.2.2 三种基因mRNA的相对表达量

（1）RNA提取和cDNA合成 采用TRIZOL法抽提肌肉组织中的总RNA，经1%的琼脂糖/EB凝胶电泳，鉴定RNA质量。使用紫外分光光度计（eppendorf BioPhotometer）测定纯度和浓度，加入RNase-free ddH2O将浓度调至500 ng/μL左右。反转录按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）使用说明进行，反转录体系为20 μL，37℃反转录15 min，后经85℃热处理灭活，4℃保存。

（2）引物设计 根据GenBank上已报道鳜（Sini-perca chuatsi）myostatin（Gene ID：JF896453.1）、MyoD（Gene ID：JN561167.1）、myogenin（Gene ID：HQ724299.1）和β-actin（Gene ID：FJ436084.1）的序列，用Primer Premier 6.0 软件结合BLAST设计特异性引物（表1）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

以反转录得到的cDNA为模板，对上述合成引物和Taq PCR MasterMix进行PCR反应。PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min。反应结束后取扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 引物序列及退火温度

（3）荧光定量PCR 取鳜鱼肌肉总RNA反转录的cDNA做10倍梯度稀释，共设6个梯度。以梯度稀释的cDNA为模板，分别以所设计的引物在实时定量PCR仪（BIO-RAD CFX96TMReal-Time System）上进行荧光定量PCR反应，以各扩增曲线的Ct值为X轴和所应各稀释梯度的对数值为Y轴，制作出myostatin、MyoD、myogenin和β-actin的标准曲线。以各样本反转录cDNA为模板，分别进行内参基因β-actin和目的基因myostatin、MyoD、myogenin的实时荧光定量反应。各时期样本进行3次生物学重复和3次技术重复，相应的空白以ddH2O为模板。

反应按照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）试剂盒使用说明，以25 μL体系，取2 μL cDNA进行扩增检测。反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，退火30 s（依据不同引物Tm值设定退火温度），40个循环；95℃ 10 s，在65-95℃做熔解曲线。

1.2.3 数据分析 荧光定量数据按照2-ΔΔCt方法计算，数据分析采用 Excel 2010（Microsoft，USA）与IBM SPSS Statistics 20，显著性分析采用单因素ANOVA Duncan方法检验（P＜0.05）。

2 结果

2.1 三种鳜鱼全长生长比较

鳜、斑鳜和斑鳜（♀）×鳜（♂）杂交一代（F1） 90 d内全长生长变化情况见图1。3种鳜鱼全长均随日龄呈增大趋势。3种鳜鱼生长间差异显著，鳜生长最快，斑鳜最慢，F1代介于斑鳜和鳜之间。

图1 斑鳜、鳜及其杂交一代不同日龄全长（n=20）

2.2 肌纤维数目与大小

3种鳜鱼背侧第一肌节肌纤维多成椭圆形或多边形，其周围包有结缔组织（图2）。

图2 不同发育时期鳜鱼背肌组织切片（20×）

2.2.1 肌纤维数目 D10日，斑鳜、鳜及其F1代背侧第一肌节中肌纤维平均数目分别为110、98、92，至D90日，增生至1 183、1 052、1 141，肌纤维数目均随日龄增加而增多（图3）。不同时期，3种鳜鱼肌纤维数目间差异不显著。

2.2.2 肌纤维直径 由于肌纤维横截面多不规则，直径测量方法参考椭圆形长短轴的测量方法求其平均直径，以横截面上最长两点间的距离作为长轴，再过其中点测出垂直于长轴的短轴长度，将长、短轴的几何平均数作为每条肌纤维的直径。3种鳜鱼肌纤维平均直径随日龄增加而增大（图4）。其中，鳜肌纤维直径增长率最快，斑鳜最慢，F1代介于斑

鳜和鳜之间。

图3 三种鳜鱼不同时期背侧第一肌节肌纤维总数目

图4 三种鳜鱼不同时期肌纤维平均直径

随日龄增大，肌纤维直径频率分布向较大直径组分散。D10和D20时，3种鳜鱼肌纤维频率分布相似。D30、D60和D90时，斑鳜最高直径组均无分布。D60和D90时，F1代在高直径组中分布频率小于鳜（图5）。

图5 三种鳜鱼不同时期肌纤维直径与频率分布图

2.3 Myostatin、MyoD、myogenin基因的表达量

Myostatin、MyoD、myogenin和β-actin标准曲线的扩增效率E值和相关系数R2数据显示，目的基因和内参基因标准曲线的线性关系良好（90%≤E≤110%，R2≥0.98），能够在所设置的浓度范围内进行准确的定量分析。myostatin基因标准曲线见图6。

鳜、斑鳜和F1代 myostatin mRNA在D20出现表达高峰，之后表达量呈下降趋势（图7-A）。D10，鳜myostatin表达量高于斑鳜和F1；D20之后，表达

量逐减；D30时，表达量高于斑鳜和F1，而D60、D90时降至最低。斑鳜表达量至D90时略有回升，而杂交一代下降趋势平稳。

图6 Myostatin基因的标准曲线

鳜、斑鳜和F1代MyoD mRNA在D10、D20表达量较高，D30之后表达量减弱（图7-B）。D10至D60，鳜MyoD表达水平始终高于F1和斑鳜，D90时降至最低。斑鳜表达量下降最慢，在D90时表达量最高。F1代D30前最低，D60、D90介于中间。

D20时，鳜、斑鳜和F1代myogenin mRNA表达量最低，D30之后均呈升高趋势（图7-C）。斑鳜表达水平保持平稳，杂交一代表达量缓慢升高，而鳜表达量升高最为明显。

3 讨论

本试验研究了斑鳜、鳜及其杂交一代孵化后90 d内全长生长、骨骼肌肌纤维生长特征，以及肌肉中myostatin、MyoD、myogenin三个基因mRNA表达量变化。不同发育时期的全长测定结果表明，D30前，斑鳜、鳜及其杂交一代全长间无明显差异，D60、D90日龄时，鳜全长值最大，斑鳜最低，而杂交一代介于双亲之间，种间生产差异显著。从骨骼肌生长来看，斑鳜、鳜及其杂交一代肌纤维数目与直径均随日龄增加而增大，同时表现出增生生长与肥大生长，肌肉生长与全长生长间变化趋势一致。不同发育时期，斑鳜、鳜及其杂交一代肌纤维数目间较为接近，不同种间无明显差异，说明鳜鱼种间生长差异与其肌纤维数目间无直接关联；而在肌纤维直径上，3种鳜鱼肌纤维平均直径大小为：鳜＞杂交一代＞斑鳜，这与3种鳜鱼全长生长差异间呈正相关关系。在肌纤维直径分组频率分布上，D30、D60、D90日龄，与鳜、杂交一代相比，斑鳜缺失最高直径组；D60、D90日龄，在高直径组中，杂交一代频率值均低于鳜。因此推测，3种鳜鱼间生长差异主要是由于肌肉肥大生长差异引起，鳜肥大生长最为显著，斑鳜肥大生长最低，杂交一代表现介于双亲中间，偏向鳜。前期形态学分析结果显示，杂交一代体型介于斑鳜与鳜之间，偏向鳜［17］。微卫星分析结果表明，杂交一代遗传杂合性高于斑鳜和鳜，在遗传特征表现上偏向鳜［18］。

图7 三种鳜鱼不同发育时期 myostatin、MyoD、myogenin mRNA相对表达水平

研究认为，myostatin可通过抑制生肌调节因子转录活性，对肌肉生长起负调控作用［19］。本研究中，D20时myostatin mRNA表达水平较高，可能与该阶段肌肉发育生长缓慢有关；D30后，表达水平不断降低，而肌肉生长发育加快。D60、D90，鳜myostatin mRNA表达水平最低，斑鳜最高，而杂交一代表达水平居中，不同种类myostatin mRNA表达

水平与其肌肉生长间呈现对应的负相关关系。

MyoD与成肌细胞增殖和肌肉增生相关［20］。D10-D20阶段，MyoD表达水平较高，可能与这一时期肌肉增生生长较快有关，后期表达水平下降，暗示肌肉增生生长下降。鳜MyoD表达水平下降最为明显，斑鳜下降趋势不明显，不同种类MyoD表达水平与其各期肌纤维数目间无直接关联。

Myogenin与成肌细胞的分化和肌肉肥大相关［21］。随发育日龄增加，其表达量呈升高趋势。在肌纤维直径的频率分布图中，高直径组及其频率随日龄增长明显，表明肥大生长加快，而较低直径组（增生生长）在逐步降低，说明肥大生长在肌纤维生长中比重逐渐增大。斑鳜表达水平保持平稳，杂交一代表达量缓慢升高，而鳜表达量升高最为明显。因此，不同种类myogenin表达水平与其肌肉肥大生长间呈明显正相关关系。

不同发育时期，3种鳜鱼的骨骼肌肌纤维总数目较为接近，不同种类间的生长差异主要由肌肉肥大生长引起。myostatin、myogenin mRNA表达水平变化与其肌肉生长间存在更为直接的相关性，它们可作为鳜鱼种间生长差异的重要候选分子标志。

4 结论

鳜、斑鳜及斑鳜（♀）×鳜（♂）杂交一代3种鳜鱼间生长差异显著，鳜生长最快，斑鳜最慢，杂交一代介于斑鳜和鳜之间。肌纤维平均直径随日龄增加而增大，其中鳜肌纤维直径增长率最快，斑鳜最慢，杂交一代介于斑鳜和鳜之间。

Myostatin、MyoD、myogenin 3个基因在不同种类鳜鱼的不同时期均有不同的表达特征，鳜、斑鳜和杂交一代 myostatin mRNA 在D20出现表达高峰，之后表达量呈下降趋势。MyoD在D10、D20表达水平较高，后期表达水平下降；Myogenin在D20时表达量最低之后，鳜表达量升高最为明显，杂交一代次之，斑鳜保持平稳。

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（责任编辑 李楠）

Comparison on Muscle Growth and Expression of Muscle Growthrelated Genes Among Three Mandarin Fishes

Xu Miaoyang1Zhao Jinliang1Li Chuanyang1Qian Yezhou2Wu Chao2Qian De2
（1. Laboratory of Freshwater Fisheries Germplasm Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Chizhou Institute of Special Aquaculture，Chizhou 247104）

Muscle samples of Siniperca chuatsi ♂×S. scherzeri ♀ F1and their parents at five developmental stages in 90 days after hatching. The skeletal muscle growth characteristics were identified by numbers and diameters of muscle fibers through paraffin sections. Meantime were obtained and the mRNA expression of myostatin, MyoD, myogenin in muscle was detected by quantitative PCR. The results showed there were significant differences in growth among three mandarin fish. Siniperca chautsi grew the fastest, F1secondly and S. scherzeri kept the last. At different developmental stages, numbers of muscle fibers in three mandarin fish showed no significant difference, while the average diameters of the muscle fibers showed positive correlation with growth rate. Growth differences among three mandarin were mainly caused by muscle hypertrophy. The myostatin mRNA expression peak appeared in D20, then the expression showed a downward trend. MyoD mRNA expressed highly in D10, D20 and decreased in following days. The myogenin mRNA expression was the lowest in D20, followed by an obviously increase in Siniperca chuatsi, and F1secondly, while S. scherzeri stable. It showed correlations between muscle growth and gene expression in three mandarin at different growth stages.

Siniperca Growth Muscle fiber Myostatin MyoD Myogenin mRNA expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.031

2014-04-15

池州市秋浦特种水产开发有限公司专项（2012A01）

许淼洋，女，硕士研究生，研究方向：水产动物遗传育种与繁殖；E-mail：ur_mysunshine@live.cn

赵金良，男，教授，博士，研究方向：水产动物遗传育种与繁殖；E-mail：jlzhao@shou.edu.cn