N-乙酰半胱氨酸对猪肠道功能的保护作用

侯永清 王 蕾 易 丹

(1.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，武汉 430023;2.武汉轻工大学动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，武汉 430023)

动物的肠道不仅是所有营养物质消化吸收的最终场所，也是机体防御体系的第一道屏障，维护动物肠道健康对保障动物生产至关重要［1］。肠道也是机体应激反应的中心器官，在实际生产中，各种应激因素会导致肠道功能紊乱［2］。肠黏膜受损可能会导致细菌易位和通透性增加，从而引起炎症和组织损伤［3］。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是天然氨基酸L-半胱氨酸与还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)的前体物质，因而在动物机体抗氧化功能中发挥重要作用，乙酰基化使其更易被吸收、抗氧化性更稳定。NAC的生理功能和应用效果在很大程度上与维持细胞内的GSH水平有关。NAC被证实可以有效改善肠道屏障功能，其机理可能与清除细胞内活性氧自由基、调节氧化应激水平和抑制炎症反应有关［4］。研究表明，NAC对肠缺血再灌注、炎症性肠病、放化疗等理化损伤、烧伤、感染、重症急性胰腺炎等多种疾病相关肠屏障功能紊乱均具有较好的防治作用［5］。最近研究发现，仔猪饲粮中添加NAC(500 mg/kg)可以缓解脂多糖(LPS)应激引起的肠黏膜损伤、乙酸刺激引起的结肠炎［6］及改善小肠吸收功能［7-8］。本文旨在就NAC对猪肠道功能的保护作用相关研究作一综述。

1 N-乙酰半胱氨酸的理化特性

NAC为硫醇类化合物，是天然氨基酸L-半胱氨酸与GSH的前体物质，分子式为C5H9NO3S，相对分子质量为163.2，是一种含活性巯基化合物，其生物活性主要在于硫基，而乙酰基使其活性更加稳定。

NAC是小分子物质，可口服、肌注、静脉给药，进入机体后97%被小肠迅速吸收，并经小肠和肝脏细胞代谢与蛋白质肽链结合形成多种代谢产物。NAC在体内脱去乙酰基后形成的半胱氨酸，半胱氨酸为GSH的前体，可通过血脑屏障和神经细胞膜转化成细胞内的GSH，具有较强的清除活性氧自由基能力［5］。

2 N-乙酰半胱氨酸对仔猪生长性能的影响

生长性能是家畜生产中的重要指标，饲粮中添加NAC有利于提高动物生长性能［7］。研究表明，饲粮中添加0.05%NAC可以提高LPS刺激仔猪的平均日增重［7，9］，说明 NAC 可以缓解 LPS刺激造成的仔猪生长性能的降低，这提示炎性应激条件下添加NAC对改善仔猪生长性能具有重要意义［7］。当前，关于NAC对猪生长性能影响的报道甚少。

3 N-乙酰半胱氨酸对仔猪肠道功能的保护作用

3.1 对仔猪肠黏膜形态的影响

小肠是消化道内营养物质吸收和转运的主要部位，小肠黏膜形态结构的完整对维持仔猪的消化吸收功能非常重要［10］。反映小肠黏膜形态最直观的指标是绒毛高度、隐窝深度、绒毛表面积。隐窝深度增加表明绒毛上皮成熟细胞减少，绒毛高度/隐窝深度比值常可说明小肠上皮细胞更新代谢程度［11］，比值下降表明黏膜细胞生长受阻，比值上升表明黏膜细胞生长良好［12］。NAC能在一定程度上促进小肠黏膜的发育，缓解LPS应激导致的肠绒毛萎缩和隐窝增深，保护小肠和结肠的形态结构的完整［6-7］。研究表明，饲粮中添加500 mg/kg的NAC可以显著降低LPS刺激仔猪小肠隐窝深度，提高绒毛高度/隐窝深度的比值和绒毛表面积［6］。这表明NAC在一定程度上加速了小肠上皮细胞的更新代谢，缓解了LPS刺激导致的肠绒毛萎缩和隐窝增深［12］。研究表明，在断奶仔猪饲粮中添加500 mg/kg的NAC可降低直肠灌注乙酸造成的仔猪结肠损伤，在该乙酸灌注结肠炎模型中，NAC可以增加杯状细胞的数量和细胞密度，降低上皮淋巴细胞和淋巴细胞密度［6］。这些结果表明，添加NAC可以维持肠道形态结构的完整，缓解LPS刺激造成的小肠黏膜的损伤及乙酸刺激造成的结肠形态结构的损伤。

3.2 对仔猪肠道吸收功能和屏障功能的影响

小肠上皮细胞层构成机体的最前沿防御屏障，具有抵御肠腔内有害微生物和潜在致病菌侵入外周脏器的作用［11，13］。D-木糖在肠道中不被消化，经吸收后又不被机体代谢，并最终经肾脏排出，其吸收试验被认为是反映肠道吸收机能的经典方法。血液中D-木糖浓度间接反映出肠道结构与功能的完整性。研究表明，饲粮中添加500 mg/kg的NAC显著提高了LPS刺激仔猪血浆D-木糖含量，表明NAC能够缓解LPS应激引起的肠道吸收功能降低。NAC缓解LPS导致的吸收功能下降的作用机制可能是因为NAC作为巯基供给剂，有助于肠道组织对氨基酸、蛋白质和多肽类亲水性化合物的吸收，以及改善肠道局部黏膜免疫和全身免疫功能，进而增强对肠组织结构和功能的保护作用［12，14］。

二胺氧化酶(DAO)主要存在于哺乳动物肠黏膜上层绒毛细胞胞浆中，是一种具有高度活力的细胞内酶［15］。血浆和肠黏膜DAO活性可作为反映肠黏膜上皮细胞成熟度及其构成的肠道屏障结构损伤与修复情况的标志物，也可反映肠黏膜通透性［12，16］。当肠黏膜细胞受损或脱落时，DAO 会释放入肠细胞间隙淋巴管和血管，或随坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔内，导致血液和肠腔DAO活性增高，肠黏膜 DAO 活性降低［8，12，17］。研究表明，饲粮中添加NAC可以缓解LPS刺激仔猪血浆DAO活性的升高及小肠黏膜DAO活性的降低［12］。类似地，NAC能显著降低大鼠血浆 DAO活性［18］;能有效改善肠黏膜通透性，防止肠道菌群失调及细菌移位［12，19］。这些结果表明，NAC 具有缓解LPS刺激造成肠黏膜通透性增加的作用。NAC的这种作用，可能是一方面NAC能直接抗氧化损伤，或通过促进机体内GSH合成来清除活性氧自由基，减轻肠道黏膜的氧化性损伤，另一方面抑制LPS诱导炎性因子产生，降低肠损伤，维持肠道完整性。

3.3 抗氧化作用

NAC可以缓解脂质过氧化介导的损伤，提高小肠的抗氧化作用。NAC为硫醇类化合物，是L-半胱氨酸与GSH的前体［5］。作为小分子物质，NAC易于进入细胞，脱乙酰基后成为GSH合成的前体，促进GSH的合成。研究表明，LPS刺激可以造成组织局部缺血和缺氧，产生大量自由基，从而导致仔猪肠黏膜受到氧化应激损伤［15，20］。NAC可以显著提高LPS刺激仔猪空肠超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，降低丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子自由基(·O-2)含量及氧化型谷胱甘肽(GSSG)/GSH比值［7］。这些结果表明，饲粮中添加NAC可以缓解LPS刺激对仔猪肠道氧化应激的不利影响［7］。SOD是体内主要的自由基清除酶，能够清除·O-2，保护细胞免受损伤，而CAT主要是将SOD歧化自由基形成的H2O2转化成H2O和O2。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化H2O2分解的酶，能特异性催化GSH对H2O2的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用［12］。MDA是脂质过氧化反应的一种重要分解产物，可以间接反映机体组织氧化损伤的程度［10］。而自由基主要有·O-2、羟自由基、H2O2等，这些自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，它们的含量高低反映了组织自由基的积累程度［21］。GSSG是 GSH的氧化形式，在氧化剂作用下GSH通过GSH-Px氧化成GSSG，而GSSG通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)供氢，在谷胱甘肽还原酶的作用下又还原成GSH，二者构成一个动态平衡，使GSSG维持在总GSH量的1% ～10%水平，构成有效的抗氧化系统，故可用来评估脂质过氧化损伤情况［22］。NAC能降低自由基等有害产物的积累，调节氧化与还原产物的比率，抑制LPS的对肠黏膜的损害。其作用可能是因为NAC为细胞内提供—SH来源，而活性—SH具有较强还原能力，对体内自由基具有明显的拮抗作用;另外，NAC能将细胞外的胱氨酸还原为半胱氨酸，并可在肠黏膜细胞中转化成GSH，进而通过GSH发挥抗氧化作用，清除体内的自由基［12］。研究发现，饲粮中添加GSH可显著降低小肠黏膜MDA含量，改善仔猪肠道的脂质过氧化损伤［23］;在培养的内皮细胞中加入NAC后，GSH/GSSG比值显著升高［24］。饲粮添加NAC可增强仔猪机体抗氧化能力，进而缓解LPS刺激导致的生长抑制［9］。

3.4 抗炎作用

NAC可在一定程度上可缓解LPS刺激导致的仔猪炎症和免疫应激反应，能有效缓解LPS刺激对小肠黏膜的应激损伤。饲粮中添加500 mg/kg NAC可以缓解LPS刺激导致的猪血浆、空肠和回肠中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)及十二指肠TNF-α含量的显著升高，有缓解十二指肠IL-6含量升高的趋势，可以缓解LPS刺激导致的小肠核因子 -κB(NF-κB)和热休克蛋白70(HSP70)蛋白水平的显著升高［7］。这些结果说明NAC可在一定程度上缓解LPS刺激导致的仔猪炎症反应。另外，饲粮中添加500 mg/kg NAC可降低血浆中皮质醇(COR)水平，说明NAC可缓解LPS刺激引起的免疫应激。因此，饲粮中添加NAC可缓解LPS刺激导致的血浆及小肠黏膜中炎性因子的升高，NAC可能通过NF-κB信号通路影响炎性因子的表达，缓解免疫应激。最新研究表明，NAC可以显著降低LPS刺激仔猪空肠和回肠Toll样受体4(TLR4)mRNA 表达［7］。TLR4是 TLRs家族中与免疫和炎症密切相关的重要成员，是介导LPS应答的主要受体，主要识别LPS介导炎症信号通路［25］。TLR 可通过下游信号分子激活 NF-κB，而活化的NF-κB可以促进炎症相关基因(如TNF-α、IL-1β和IL-6)的过量表达，从而导致组织的损伤［25］。其可能作用机理是:1)NAC在体内脱乙酰基生成的半胱氨酸可促进GSH的合成，提高组织内GSH含量。GSH可抑制IκB磷酸化，促进IκB/NF-κB三聚体的稳定性，阻止 NF-κB的p65亚基向核内转移，从而抑制 NF-κB活化和核移位［26-27］。NF-κB 活性受抑制后，其调控转录的炎性细胞因子TNF-α和IL-6产生、释放也相应地减少，最终趋向平衡，肠黏膜免疫应激得到缓解［26］。2)NAC通过调控TLR4基因表达来调节炎症因子的表达，进而发挥保护肠道的作用［7］。

3.5 对肠道能量代谢状况的影响

LPS刺激可阻碍小肠黏膜线粒体正常的能量代谢，降低小肠黏膜能量供应和储备［28］。研究表明，饲粮中添加NAC可缓解LPS刺激导致的小肠三磷酸腺苷(ATP)、腺苷酸池(TAN)和能荷(EC)水平的降低，以及一磷酸腺苷(AMP)水平和AMP/ATP比值的升高［26］。ATP是各种生命活动所需能量的直接来源，2分子二磷酸腺苷(ADP)转化成1分子ATP和AMP(2ADP↔ATP+AMP)，这个反应始终保持动态平衡，构成ATP循环［29］。TAN是ATP、ADP和AMP之和。EC反映高能磷酸键在ATP、ADP、AMP之间的相互转换，细胞能量产生不足或消耗增加时，均会影响EC水平［10］。另外，饲粮中添加500 mg/kg NAC可缓解LPS刺激引起的空肠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)比值的升高［26］。AMPK能感知细胞能量代谢状态的改变，维持机体的能量代谢平衡，被称为“能量开关”，在动物应激(生理、营养、环境和疾病等)过程中起着重要作用［10］。在一般生理条件下，细胞内AMP含量极低，AMPK处于静息状态。当机体处于应激状态时(如LPS刺激)，细胞内AMP/ATP比值升高，启动 AMPK 激酶系统，AMPK 被激活［26，30］。研究发现，LPS刺激显著提高了仔猪小肠AMP/ATP比值，AMPK磷酸化程度增加［31］。饲粮中添加NAC可以:1)提高ATP;2)降低AMP/ATP比值;3)提高EC;4)抑制LPS刺激仔猪小肠黏膜AMPK磷酸化的提高［26］。这表明饲粮中添加NAC可以提高仔猪小肠黏膜腺苷酸水平，增加肠黏膜能量储备，缓解LPS刺激导致的能量过度损耗。可能的机制是:LPS通过AMP/ATP激活AMPK，添加NAC后可以抑制这一途径，从而缓解LPS应激对仔猪肠黏膜造成的能量代谢障碍，有利于肠黏膜屏障保护［26］。

3.6 抗细胞凋亡，促进细胞生长

NAC有抗细胞凋亡作用，能促进细胞生长［32］。研究表明，饲粮中添加500 mg/kg的NAC可以缓解LPS刺激引起的空肠DNA含量、RNA/DNA和蛋白质/DNA比值的降低［7］。另外，NAC可以缓解乙酸刺激仔猪结肠蛋白质/DNA比值［6］。DNA 含量、RNA/DNA 和蛋白质/DNA 比值可以反映肠黏膜细胞生长发育的状况［7，33］。DNA含量反映细胞数量，代表着生成新柱状上皮细胞的有丝分裂速率［12，33］;RNA/DNA 比值反映组织活性和单个细胞的转录效率;蛋白质/DNA比值反映细胞蛋白质合成效率［7，33］。这些结果表明，NAC可以促进肠黏膜细胞的生长，缓解LPS或乙酸灌注导致的肠黏膜受损，利于肠道屏障功能的恢复。

NAC的这种作用可能是通过调节caspase-3表达，抑制细胞凋亡。caspase-3作为细胞凋亡信号，其蛋白质的表达高低可以反映机体在遭受应激损伤时的细胞凋亡程度［12］。研究表明，LPS刺激或乙酸灌注结肠可以通过提高小肠［8］或结肠［6］caspase-3蛋白表达。饲粮中添加NAC可以显著降低LPS刺激仔猪小肠caspase-3蛋白表达［8］及乙酸灌注结肠caspase-3蛋白表达［6］。

另外有研究发现，NAC能显著提高仔猪血液中表皮生长因子(EGF)水平，缓解LPS刺激造成的生长抑制［9］。研究发现，NAC可以显著提高LPS刺激仔猪血液中EGF含量及小肠黏膜中EGF受体(EGFR)mRNA 的表达［7］。类似地，NAC 可以显著提高乙酸刺激仔猪结肠黏膜中EGF mRNA的表达［6］。EGF和EGFR有促进仔猪肠道发育、修复炎症性肠炎导致的仔猪受损肠道的作用［7］。EGF可以促进肠道黏膜上皮细胞的增殖和分化，减轻多种原因对胃肠道形态的损害，对维持胃肠道结构和功能的完整性起到重要作用［7，34-35］。EGFR信号通路对肠道具有十分重要的作用［7，36-37］，包括促进细胞增殖、修复、稳定肠道内环境等。饲粮中添加500 mg/kg的NAC可以提高仔猪EGF和EGFR，这与NAC能对抗肠黏膜细胞凋亡(抑制LPS刺激仔猪肠道caspase-3蛋白表达)，缓解LPS刺激导致的不利影响的观点一致。我们推测，饲粮中添加NAC能对抗肠黏膜细胞凋亡，促进细胞增殖和生长修复，缓解肠道损伤，可能是通过调节EGFR信号通路来实现的。

3.7 调控紧密连接蛋白的表达

NAC可以调控仔猪肠道紧密连接蛋白的表达。正常机体的上皮细胞、内皮细胞间存在着紧密连接成分，对维持细胞的正常结构和功能非常重要［12］。参与紧密连接的蛋白主要有闭锁(occludin)蛋白、claudin蛋白以及黏附分子(JAM)等［38］。occludin和claudin-1是构成紧密连接的主要跨膜蛋白［38］，可以封闭细胞间隙，保持上皮、内皮细胞的连续性和完整性，对于维持紧密连接的结构和功能具有重要作用。紧密连接蛋白的表达量高低，可以直接反映紧密连接的结构和功能的完整性，间接反映肠道屏障功能的状况。研究表明，饲粮中添加NAC可以显著提高LPS刺激仔猪小肠claudin-1和occludin相对表达量［7］及乙酸刺激仔猪结肠 claudin-1相对表达量［6］。这说明NAC可能是通过调节claudin-1或occludin蛋白表达促进了紧密连接，抑制了LPS或乙酸刺激导致的肠黏膜细胞通透性的增加，增强抗炎作用，改善了肠道屏障功能［8］。

4 小结

饲粮中添加NAC可以缓解LPS刺激造成的仔猪生长性能的降低;可以维持肠道形态结构的完整，缓解LPS刺激造成的小肠黏膜的损伤及乙酸刺激造成的结肠形态结构的损伤，改善猪肠道吸收功能和屏障功能。因此，NAC对猪肠道功能具有保护作用，其可能的机制是通过1)降低氧化应激(提高抗氧化物酶的活性，降低氧化相关产物的含量，抑制HSP70的高度表达);2)抗炎作用(降低炎性相关指标含量，抑制NF-κB p65蛋白和TLR4 mRNA表达);3)改善肠黏膜能量代谢状况(提高 ATP和 EC、降低 AMP/ATP及磷酸化AMPK蛋白表达);4)抗细胞凋亡，促进细胞生长(降低caspase-3蛋白表达，提高EGF含量和EGFR mRNA表达);5)调节紧密连接蛋白表达(提高claudin-1和occludin蛋白表达)。这些研究结果不仅为克服普遍发生的仔猪肠道功能紊乱提供重要思路，也为炎性条件下改善婴儿营养与健康提供重要参考。

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