氟西汀对hERG钾通道的阻断作用及佛波酯的抑制作用

汪溪洁，惠涛涛，宋 征，马 璟

(国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203)

氟西汀对hERG钾通道的阻断作用及佛波酯的抑制作用

汪溪洁，惠涛涛，宋 征，马 璟

(国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203)

目的 探讨氟西汀对hERG(ether-a-go-go-related gene)钾通道的作用及蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波酯(PMA)对氟西汀作用的影响。方法 采用全细胞膜片钳技术记录氟西汀0.01,0.1,1和10 μmol·L－1处理后稳定表达hERG钾通道的HEK293细胞(hERG-HEK293稳态细胞)上hERG钾通道电流(IKr)的变化,研究氟西汀对IKr作用的浓度依赖性和电压依赖性,并观察氟西汀1 μmol·L－1处理后hERG钾通道激活、失活和复活动力学的变化。在此基础上,观察PMA 1 μmol·L－1对氟西汀1 μmol·L－1作用IKr后的影响。结果 氟西汀0.01,0.1,1和10 μmol·L－1对hERG-HEK293稳态细胞上IKr具有浓度依赖性和电压依赖性的抑制作用,半数抑制浓度(IC50)约为0.8 μmol·L－1,Hill系数约为1.1。氟西汀1 μmol·L－1可以减小IKr激活、失活和复活电流,并影响hERG钾通道的激活和复活过程。在氟西汀对IKr电流的抑制作用达到稳态后,PMA 1 μmol·L－1可抑制氟西汀对hERG钾通道的阻断作用。结论 氟西汀对hERG-HEK293稳态细胞上hERG钾通道具有明显的阻断作用,该作用可被PKC激动剂PMA抑制。

氟西汀；hERG；膜片钳技术；全细胞记录

抑郁症是危害人类健康的慢性疾病，据世界卫生组织预测，到2020年抑郁症将成为仅次于心血管疾病的第二大疾病。氟西汀是一种选择性5-羟色胺重摄取抑制剂类抗抑郁药，广泛应用于临床。已证实氟西汀是一种可诱发QT间期延长的药物[1]，其作用机制尚未十分明确。

自1964年Selzer和Wray[2]报道了奎尼丁引起QT间期延长和室颤发作的病例以来，由各种不同药物引起的QT间期延长时有报道。迄今为止，已发现的QT间期延长致病基因有10个，分别编码不同的通道亚单位[3]。人类ether-a-go-go相关基因(human ether-a-go-go related gene，hERG)编码的钾通道被认为是诱发QT间期延长的药物优先阻滞的主要离子通道之一。hERG钾通道编码快速型延迟整流钾通道(rapidly delayed rectifier potassium channel，Ikr)的α亚基[4]，是一种电压门控型钾离子通道，主要表达在心肌[5]，并在心肌细胞动作电位的复极化过程中扮演重要角色。阻断hERG钾通道，可诱发QT间期延长，最终甚至导致尖端扭转型室性心动过速(torsade de pointes，Tdp)。已有资料表明，hERG钾通道的功能受到多种因素的调节[6－9]，目前研究的较清楚的有蛋白激酶 C (protein kinases C，PKC)、PKA、肾上腺素能受体和Src家族蛋白酪氨酸激酶等。本文应用全细胞膜片钳技术，通过观察氟西汀对hERG-HEK293细胞上hERG钾电流的作用，了解其对hERG钾通道的作用特征，并初步探讨了 PKC激动剂佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)对氟西汀作用hERG钾通道的影响，为氟西汀临床安全用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

稳定表达hERG钾通道的HEK293细胞株(hERG-HEK293稳态细胞，S.A.R.L CREACELL，法国，批号:APC092811)。

1.2 试剂和溶液配制

高糖DMEM培养基、EDTA、胎牛血清、青链霉素、G418和Accutase消化液均购自美国Gibco公司；PMA，氟西汀，NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，HEPES，葡萄糖，EGTA和Mg-ATP均购自美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

细胞外液(mmol·L－1):NaCl 140，KCl 4.5，MgCl21，CaCl22，HEPES 10，葡萄糖10，NaOH调节pH至7.2～7.4；

电极内液(mmol·L－1):KCl 140，Mg-ATP 4，MgCl21，EGTA 5，HEPES 10，KOH调节pH至7.2～7.4；

封接液(mmol·L－1):NaCl 80，KCl 3，MgCl210，CaCl235，HEPES 10，NaOH调节pH至7.2～7.4。

1.3 主要仪器

Patchliner NPC16(Nanion，德国)，EPC10膜片钳放大器(HEKA，德国)，倒置显微镜(IMT-2，Olympus，日本)，细胞培养箱(Forma Scientific，美国)。

1.4 hERG-HEK293稳态细胞的培养

hERG-HEK293稳态细胞株接种于含DMEM-10培养液(DMEM高糖培养液含1.2 g·L－1G-418、10%胎牛血清以及青霉素100 KU·L－1和链霉素100 g·L－1)的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每2 d更换1次培养液。

1.5 hERG-HEK293稳态细胞的准备

取光镜下细胞色泽较亮，无明显的漂浮细胞，弃取培养液，加入约1 mL Accutase消化液消化，约1 min后加入DMEM-10培养液吹打，使细胞悬浮，将细胞悬液转入一离心管中，184×g离心约5 min，弃去上清液，加入约2 mL细胞外液，吹打使细胞悬浮。然后将吹打后的细胞悬液转入 Patchliner NPC16工作站的细胞槽中。

1.6 全细胞膜片钳记录

实验在室温(22±2)℃下进行。运用EPC10膜片钳放大器和Patchliner NPC16工作站完成全细胞模式的电压钳记录。首先由Patchliner NPC16工作站的机械臂将细胞悬液加到芯片上，通过调节压力和吸力，将一个细胞定位在芯片的一个小孔上(相当于微管电极的尖端)。然后由 Patchliner NPC16工作站完成封接过程，当芯片电极与细胞膜之间形成高阻抗封接(＞1 GΩ)后，进一步加负压破膜，使电极内液与细胞内液相通，形成全细胞记录模式，待破膜稳定后补偿膜电容(Cs)及局部串联电阻(Rs)。采集和滤波频率分别为 20 kHz和3 kHz。实验过程中芯片电阻为 2～5 MΩ，Rs＜15 MΩ，且以电流稳定的数据为有效数据。记录加入化合物前hERG钾电流(IKr)作为对照，然后换以含氟西汀0.01，0.1，1.0和10 μmol·L－1或PMA 1 μmol·L－1的细胞外液持续记录5 min以上，分别记录加入药物后的IKr。实验过程中，由PatchMaster软件与EPC10放大器连接，用于控制放大器、采集和存储电流信号及在线分析等，Patchcontrol HT则用于完成实验操作。

1.7 电流记录程序

hERG钾通道尾电流:钳制电压为－80 mV，去极化到 ＋40 mV，时程为2000 ms，然后复极化到－30 mV，时程为2000 ms；

hERG钾通道激活电流:钳制电压为－80 mV，先给予一组－50～＋60 mV、10 mV递增、时程为2000 ms的指令电压刺激，再给予在－30 mV，2000 ms的指令电压；

hERG钾通道失活电流:钳制电压为－80 mV，先给予＋20 mV、2000 ms的预刺激，再给予一组－130～＋20 mV、10 mV递增、时程为30 ms的条件电压刺激，随后给予＋20 mV、500 ms测试脉冲电压；

hERG钾通道复活电流:钳制电压为－80 mV，先给予一组＋20 ms、时程为20～1420 ms、100 ms递增的预刺激脉冲，再给予在－40 mV、5000 ms的测试脉冲电压。

1.8 数据分析及统计学处理

采用Igor 6.05与Sigmaplot 8.0软件完成数据处理，SAS 9.1软件完成统计分析，实验数据以表示，应用方差分析和t检验进行统计，以P＜0.05为差异有显著性。采用 Hill方程(即 I＝Imax·拟合得到浓度效应曲线(Imax代表饱和浓度时的最大反应，C1/2为半数抑制浓度，[C]指药物的浓度，h为 Hill系数)，获得药物作用的IC50；以膜电位为横坐标，以标化的IKr值为纵坐标，获得加药前后的电流-电压(I-V)曲线；先以方程G＝I/(Vm－VhERG)计算电导(G为峰电导，I峰电流，Vm为膜电位，VhERG为翻转电位)，再以 G与Gmax的比值对 Vm作图，数据经 Boltzman方程G/Gmax＝1/{1＋exp[(Vm－V1/2)/k]}(Gmax为峰电导的最大值，V1/2半数激活电压，k激活斜率因子)拟合得到IKr的激活曲线；以I与Imax的比值对Vm作图，数据经Boltzman方程I/Imax＝1/{1＋exp[(Vm－V1/2)/k]}(Imax为峰尾电流的最大值，Vm为膜电位，V1/2半数失活电压，k失活斜率因子)拟合得到IKr的失活曲线；以测试脉冲刺激下记录的电流峰值(I2)与不同时程超极化预刺激下记录的电流峰值(I1)的比值(I2/I1)对应预刺激脉冲时间用单指数方程拟和得到复活曲线。

2 结果

2.1 氟西汀对hERG-HEK293稳态细胞上hERG钾通道IKr的作用

2.1.1 氟西汀对ItaiI抑制作用的浓度依赖性

氟西汀0.01，0.1，1和10 μmol·L－1对IKr有抑制作用，经细胞外液冲洗后，可部分恢复(图1)。经Hill方程拟合得到氟西汀作用的浓度-效应曲线(图2)，随着浓度升高，氟西汀对IKr的抑制作用越明显，提示该抑制作用具有浓度依赖性，半数抑制浓度IC50为(0.8±0.05)μmol·L－1，Hill系数 h为1.1±0.10(n＝5，P＜0.05)。选择氟西汀1 μmol·L－1进行后续研究。

Fig.1 Effect of fIuoxetine on ether-a-go-reIated gene (hERG)potassium channeI currents(IKr)of HEK293 ceIIs that stabIy expressed hERG potassium channeI (hERG-HEK293 steady-state ceIIs).Traces of IKrevoked in the control and presence of fluoxetine 0.01，0.1，1 and 10 μmol·L－1in a whole-cell patch-clamp configuration.

Fig.2 Concentration-response curve for the bIocking action of fIuoxetine on IKr.，n＝5.∗P＜0.05，compared with the control.

2.1.2 氟西汀对IKr抑制作用的电压依赖性

氟西汀1 μmol·L－1可明显抑制IKr电流，从I-V曲线可见，随着去极化程度的增加，IKr减小的程度越大，提示氟西汀对IKr的抑制作用具有明显的电压依赖性(图3)。

Fig.3 Effect of fIuoxetine 1 μmoI·L－1on current-voItage reIationship of IKr.n＝4.

2.1.3 氟西汀对hERG钾通道激活动力学的影响

氟西汀1 μmol·L－1可减小IKr激活电流，经Boltzmann方程拟合得到激活曲线，加药前后IKr的半数激活电压V1/2分别为(18.9±2.8)mV和(22.9± 3.3)mV(n＝4，P＜0.05)，激活斜率因子k值分别为16.5±1.7和15.1±2.1，提示氟西汀1 μmol·L－1使IKr激活曲线向去极化方向移动了约4 mV(图4)。

Fig.4 Effect of fIuoxetine 1 μmoI·L－1on activation dynamics of hERG potassium channeI.n＝4.

2.1.4 氟西汀对hERG钾通道失活动力学的影响

氟西汀1 μmol·L－1可减小IKr失活电流，经Boltzmann方程拟合得到失活曲线，加药前后IKr的半数失活电压V1/2分别为(－87.0±6.5)mV和(－89.9± 5.8)mV(n＝4，P＞0.05)，失活斜率因子k值分别为－19.6±3.8和－19.8±3.2，提示氟西汀1 μmol·L－1对IKr失活曲线几乎无影响(图5)。

Fig.5 Effect of fIuoxetine 1 μmoI·L－1on inactivation dynamics of hERG potassium channeIn＝4.

2.1.5 氟西汀对hERG钾通道复活动力学的影响

氟西汀1 μmol·L－1可减小IKr复活电流，经单指数方程拟和得到复活曲线，加入氟西汀前后复活时间常数τ分别为(71.4±3.4)ms和(82.0±2.2)ms (n＝3，P＜0.05)(图6)。

Fig.6 Effect of fIuoxetine 1 μmoI·L－1on recovery dynamics of hERG potassium channeI.n＝3.

2.2 PMA对氟西汀抑制IKr作用的影响

氟西汀1 μmol·L－1可使IKr明显减小，电流为加药前的(36.6±7.1)%，待作用稳定后，加入PMA 1 μmol·L－1，IKr轻微增大，电流为加药前的(50.7± 4.4)%(n＝3，P＜0.05)(图7)。

Fig.7 Inhibition of phorboI-12-myristate-13-acetate (PMA)on the bIocking effect of fIuoxetine on IKr.

3 讨论

本研究表明，氟西汀可抑制IKr，随着浓度升高，抑制作用越明显，提示氟西汀对hERG钾通道的阻断作用具有浓度依赖性。经细胞外液冲洗后，可部分恢复，提示氟西汀对IKr的抑制作用具有一定的可逆性。IC50约0.8 μmol·L－1，Hill系数约1.1，提示氟西汀对hERG钾通道的作用位点可能是唯一的。Thomas等[10]于2002年报道了氟西汀对hERG钾通道的IC50为3.1 μmol·L－1，略高于本实验的结果，可能的原因如下:①他们采用的表达hERG钾通道的爪蟾卵母细胞，该方法是将hERG基因注入爪蟾卵细胞进行表达 hERG钾通道，操作比较复杂；②爪蟾卵母细胞为异源细胞，与人细胞存在着种属的差异，药物对爪蟾卵母细胞上的hERG电流的IC50通常是偏高的。Snyders等[11]于1996年首次提出HEK293细胞可以稳定地表达hERG基因。HEK293细胞是转染腺病毒EIA基因的人肾上皮细胞系，属于人源性细胞，该细胞含有SV4O复制起始点和启动子区的质粒可以复制，因此可连续传代培养而保持表型稳定，具有转染率高，蛋白表达水平高，转染后表达的蛋白易检测的优点。本实验选用更接近人体的哺乳细胞系上稳定表达hERG基因的HEK293细胞，可以消除异源性细胞所带来的种属差异。

本研究结果显示，氟西汀1 μmol·L－1可明显抑制IKr，随着电压的升高，抑制作用越明显，提示氟西汀对hERG钾通道的阻断作用具有电压依赖性。氟西汀1 μmol·L－1减小hERG钾通道激活和失活电流，使hERG钾电流激活曲线向去极化方向移动了约4 mV，失活曲线几乎不改变，提示氟西汀可使hERG钾通道的激活阈值轻微增高，失活阈值不变，进而使hERG钾通道开放电位范围轻微减小，开放时间略有缩短。当去极化时间较短，通道几乎不开放时，抑制作用很小，当通道完全开放时，抑制作用达到最大。其后，随着时间继续延长，药物阻断作用达平台期。氟西汀1 μmol·L－1可减小hERG钾通道的复活电流，复活时间常数ι增加了约10 ms，提示氟西汀使hERG钾通道的复活时间延长，影响了电流失活后复活的速度。

抗抑郁药自20世纪50年代初问世以来，不断有报道服用抗抑郁药的患者出现心血管系统的不良反应，其毒性机制目前也是人们研究的热点[12]。氟西汀是临床上常用的选择性5-羟色胺重摄取抑制剂类抗抑郁药，1998年Raviña等[13]报道了抑郁症患者服用氟西汀后心电图显示T波倒置及严重变形，同时出现窦性心动过速，并伴随T波电交替和QT间期延长，患者出现晕厥，停药2个月后心电图恢复正常，其后陆续有报道显示氟西汀可致QT间期延长。本研究结果表明，氟西汀阻断hERG钾通道可能是其致QT间期延长的主要原因之一，氟西汀可能通过阻断hERG钾通道，引起外向钾离子电流减少，从而使心肌细胞动作电位QT间期延长，最终甚至导致Tdp。

既然hERG编码的钾通道在氟西汀致QT间期延长的过程中扮演重要角色，我们推测调节hERG钾通道的功能可能影响氟西汀对hERG钾通道的作用。既往的资料显示，hERG钾通道的功能受到多种因素的调节，PKC是其中一个主要的调控因素[6，14－15]。非特异PKC激动剂PMA能诱导hERG的激活，而PKC抑制剂bisindolylmaleimideⅠ能阻断hERG钾电流，Cockerill等[14]还研究发现PKC介导了表达于HEK293中hERG钾通道亚单位的直接磷酸化和毒蕈碱对hERG钾电流的调节。本研究表明，氟西汀1 μmol·L－1可使IKr明显减小，加入PMA 1 μmol·L－1后IKr轻微增大，提示PMA可抑制氟西汀对hERG钾通道的阻断作用，其机制有待进一步研究。

总之，氟西汀对稳定表达hERG钾离子通道的HEK293细胞上hERG钾通道具有明显的抑制作用，该作用可被PKC激动剂PMA影响，这不仅为深入探讨氟西汀致QT间期延长从而引发心脏毒性的机制提供了依据，对选择性5-羟色胺重摄取抑制剂类抗抑郁药在临床上安全应用也具有重要意义。

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BIocking effect of fIuoxetine on hERG potassium channeI activity and inhibition by phorboI-12-myristate-13-acetate

WANG Xi-jie，HUI Tao-tao，SONG Zheng，MA Jing
(National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation＆Research，Shanghai201203，China)

OBJECTIVE To investigate the action mechanism of antidepressant fluoxetine on hERG (ether-a-go-go-related gene)potassium channel，and the effect of protein kinase C(PKC)agonist phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)on fluoxetine inhibition.METHODS The whole cell patch clamp technique was used to record the change in hERG potassium current(IKr)on HEK293 cells that stably expressed hERG potassium channel(hERG-HEK293 steady-state cells)，which was treated with fluoxetine 0.01，0.1，1 and 10 μmol·L－1，to study the concentration-and voltage-dependence of the effects on IKr，and to observe the changes in activation，inactivation and recovery dynamics of hERG potassium channel treated with fluoxetine 1 μmol·L－1.On this basis，the effect of PMA of 1 μmol·L－1on inhibition of fluoxetine 1 μmol·L－1was explored.RESULTS Fluoxetine 0.01，0.1，1 and 10 μmol·L－1inhibited IKron hERG-HEK293 steady-state cells in a concentration-and voltage-dependent manner.The half maximal inhibitory concentration(IC50)was about 0.8 mmol·L－1，and the Hill coefficient was about 1.1. Fluoxetine 1 μmol·L－1could reduce the activation，deactivation and recovery currents of IKrand affect the activation and recovery of hERG potassium channel.After fluoxetine inhibition of IKrbecame stable，PMA 1 μmol·L－1could inhibit the blocking effect of fluoxetine on hERG potassium channels.CONCLUSION Fluoxetine has obvious inhibitory effect on IKrof hERG-HEK293 steady-state cells，but the effect could be inhibited by PKC agonist PMA.

fluoxetine；hERG；patch clamp techniques；whole-cell recording

MA Jing，Tel:(021)50801763，E-mail:jma＠ncdser.com

R966

:A

:1000-3002(2014)06-0844-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.005

Foundation item:The projectsupported by NationalScience and Technology MajorProjectof China (2012ZX09505001-003)；and Shanghai Science and Technology Innovation Action Plan Project(13140900900)

2014-01-13 接受日期:2014-06-30)

(本文编辑:乔 虹)

国家重大科技专项(2012ZX09505001-003)；上海市科技创新行动就计划项目(13140900900)

汪溪洁(1979－)，女，博士，副研究员，从事心脏毒理学研究，Tel:13585600131，E-mail:xjwang＠ncdser.com；马 璟(1963－)，女，博士，研究员，博士生导师，从事毒理学研究

马 璟，Tel:(021)50801763，E-mail: jma＠ncdser.com