大鼠骨骼肌超微结构及恢复因子的变化

王雅一

(重庆体育科学研究所，重庆 400015)

离心运动导致骨骼肌超微结构的改变已经被很多学者研究证实，目前的研究结果认为肌肉收缩时产生的机械牵拉可破坏肌细胞的超微结构,造成肌肉损伤,称为运动性骨骼肌损伤(EIMI)[1]。有学者认为，大强度运动导致骨骼肌肌节重塑，使再次运动时导致的肌肉损伤减轻[2-4]。本研究通过为期7天的离心运动训练观察骨骼肌超微结构的损伤程度以及通过测定增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，进一步探讨骨骼肌自我修复的过程。

PCNA(proliferating cell nuclear antigen),又称周期蛋白(Cy-clin),是一种仅在增殖细胞内合成和表达的酸性多肽，其主要表达在细胞周期G1-S期的增殖细胞中,是真核细胞DNA合成所必须的一种核蛋白。在静止期细胞中的含量很少,G1晚期开始增加,S期达到高峰,在G2期和M期逐渐减少到含量甚微，这表明PCNA的出现与细胞增殖周期密切相关，是反映细胞增殖活性的重要生物学指标,PCNA可与蛋白因子结合参与细胞周期调控、DNA修复以及细胞凋亡等过程。

1 材料与方法

1.1 动物分组及取样

实验动物为清洁级健康雄性(Sprague dawley)大鼠36只，6周龄，平均体重为200±13.42g,动物生产许可证号：SCXK(苏)2007-0001，国家标准固体混合饲料喂养,自由饮水。适应性喂养1周后，随机分为6组，每组6只。实验分组为:安静对照组(control,C)此组不进行任何训练。运动组大鼠在尾部负重为3%体重，并进行连续7天的力竭游泳运动。分为力竭运动后即刻(Exhaustive,E0)、恢复12h组(E12)、恢复24h组(E24)、恢复48h组(E48)、恢复72h组(E72)，均为末次力竭后宰杀。

1.2 取样和切片的制备

取材时间在力竭运动组末次运动结束后，清醒、空腹状态下，乌拉坦腹腔麻醉，迅速取一侧胫骨前肌，置于2.5%戊二醛固定，用于制作电镜超薄切片。取另外一侧置于液氮保存，用于免疫印迹。

组织取材后，从对照组、力竭E0、E24组随机抽取6只大鼠的骨骼肌标本，立刻投入4%的多聚甲醛中固定2h以上，磷酸缓冲液清洗后在1%的锇酸溶液中固定1h，然后按常规电镜样本制备方法脱水、渗透、包埋、超薄切片。在透射电镜下定性观察组织细胞核及线粒体等细胞器的形态变化以及肌纤维超微结构损伤程度。

1.3 增殖细胞核抗原(PCNA)检测

采用western blot法测定，电泳仪型号为DYY-6C，来自北京六一仪器厂，电泳槽型号为Mini-垂直165-8000，来自BIO-RAD公司，转移槽型号为VE-186，来自 Tanon公司，实验过程严格按照标准的western blot程序进行。

1.4 统计学分析

数据通过SPSS17.0统计分析，数据以标准差形式表示“X±S”，各统计学分析采用单因素方差分析和独立样本t检验,P<0.05表示为显著性差异,P<0.01表示为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 大鼠骨骼肌在大负荷运动后以及恢复期超微结构的改变

电镜显示：大鼠安静状态下，清晰可见大鼠骨骼肌肌丝完整，Z线并无断裂或是扭曲，细胞器外膜完整，内质网、线粒体均完整，并无受损。通过放大电镜倍数，可以更加直观的看到大鼠安静状态下，骨组织内肌原纤维排列整齐，z线、H带、界线清晰，组织内各类细胞器均外膜完整，内部的基质均正常。(图1)

图1 对照组C(×26500倍)

大鼠在大负荷运动后即刻组E0(图2)显示大鼠骨骼肌内肌原纤维排列不整齐，开始紊乱，z线开始扭曲，有溶解的趋势，肌间隙开始增宽。通过放大电镜倍数后，可以更加清晰的看到肌原纤维排列紊乱，z线扭曲，有的甚至发生溶解，H带、I带、M线都已经消失，无法辨别，周围的细胞器外层膜模糊不清，肌间隙增宽，并出现空泡化。力竭运动后24h(E24组)电镜下显示骨骼肌内部改变，肌原纤维完全紊乱，处于扭曲的状态，同时空泡化很严重，z线模糊，溶解。放大电镜倍数显示大鼠的肌原纤维紊乱，z线溶解，消失,周围的细胞器空泡化增多。(图3)

图2 力竭即刻E0组(×25600倍) 图3 力竭运动组E24组(×18500倍)

2.2 增殖细胞核抗原(PCNA)的表达

大负荷运动后大鼠骨骼肌内增殖细胞核抗原PCNA含量变化，其中安静组内的PCNA含量很少，而在力竭运动组E12-E72组的增殖细胞核抗原含量均有显著增加(P<0.05)，显示此时大鼠内由于损伤导致增殖细胞核抗原含量的增加，大鼠内自体修复过程在E24达到峰值(P<0.01)。(表1，图4)

表1 PCNA的Western Bolt 分析结果

图4 大负荷运动以及恢复期各组大鼠骨骼肌中增殖细胞核抗原(PCNA)的变化

3 分析与讨论

3.1 大负荷运动及恢复期间大鼠骨骼肌超微结构的改变

运动性骨骼肌微损伤是竞技体育中常见问题，为了更加直观的观察与研究，目前多以动物活体实验为主，探讨骨骼肌微损伤直观研究以及自体修复过程。 Newham[5]研究表明,肌肉牵拉练习后,可见肌节结构破坏,细胞膜通透性增高,纤维变性,巨噬细胞浸润等组织学改变。崔玉鹏[6]等研究大鼠不同负荷游泳运动后比目鱼肌Z线变化的结果表明，肌纤维A带拉长，H带结构不清楚，Z线流、Z线局灶性溶解、断裂和消失，同时观察到线粒体和肌质网等细胞器有不同程度的肿胀和扩张。金其贯[7]等让大鼠进行200 min的下坡跑离心运动,1次离心运动后即刻,大鼠股四头肌的超微结构出现肌原纤维排列不规则；局部Z线不规则,变细,肌丝排列混杂卷曲。离心运动后24 h,大鼠股四头肌出现肌原纤维排列紊乱,扭曲,且具有轻度溶解、断裂现象; Z线不规则,可见Z线流,呈锯齿状,局部Z线消失;T小管和肌浆网模糊不清。

本实验研究发现，安静对照组中的肌原纤维内I/H带、z线、细胞器等未发生改变，呈正常的超微结构特征。力竭运动组中的E24组，出现I/H带模糊、肌原纤维完全紊乱、处于扭曲的状态、同时空泡化很严重、z线也紊乱、线粒体内的嵴密集程度减少。本实验与多数学者微损伤的研究结果相符，从力学角度来说，游泳运动模型相对于跑台运动模型，骨骼肌的内部机械损伤刺激缓和些，因此，电镜下观察骨骼肌超微结构的破坏程度与跑台模型相比轻微些。

3.2 大负荷运动及恢复期间增殖细胞核抗原的变化

Forrest[8]等研究认为大强度运动后，随着自由基的增多，细胞抗氧化能力降低，膜脂质被过氧化后，进一步攻击位于核小体之间的组蛋白成分，导致碱基修饰、碱基丢失、单链和双链DNA 的断裂、DNA 交链而造成DNA 损伤，引起细胞凋亡，造成骨骼肌细胞的微损伤。顾荣瑞[9]等研究发现一次性力竭运动使大鼠股四头肌红肌自由基水平升高,从而导致股四头肌红肌生物膜的完整性丧失及损害,使肌肉工作能力下降而产生疲劳。增殖细胞核抗原(PCNA)可与蛋白因子结合参与细胞周期调控、DNA修复以及细胞凋亡等过程。由于其特殊的三聚体保守结构，不仅参与DNA复制过程同时也可与各类蛋白相互作用，达到DNA修复作用。在DNA复制过程中，PCNA作为重要的调控者，协调各个步骤有序的进行，使得不同蛋白质的结合和解离依次进行，从而确保了遗传干细胞的迅速增殖时，将遗传基因准确的正确的传递给子细胞。

Parrllla[10]和Friedrieh[11]研究发现PCNA参与DNA的修复过程的作用以及参与的途径并不是单一的，已证明PCNA能够与检验点蛋白Radg和Husl相互作用，而Radg，Husl与Radl形成一个称为9-1-1环状复合体，将多种修复相关蛋白引导到损伤部位，因此PCNA可能在这个复合体中协调细胞周期阻滞与DNA损伤修复两个功能的转换。本实验结果显示，力竭运动即刻和恢复12、24、48、72 小时大鼠骨骼肌PCNA表达与安静对照组相比有显著性差异，特别是在力竭运动的E24组表达最为明显,表明7天力竭游泳运动导致大鼠骨骼肌出现微损伤，PCNA作为DNA的修复的参与者，发挥其特殊的生物学效应促进大鼠组织损伤修复。PCNA多作为医学领域中与肿瘤、肺癌等癌症疾病的分型、发展、分化程度有关，而将运动与PCNA的相关联的报道很少，本实验只是探讨初期，仍需要进一步的探讨。

4 结束语

7天力竭的大负荷训练可引起一定的骨骼肌微损伤，在力竭训练后以及恢复期间，大鼠骨骼肌中的增殖细胞核抗原(PCNA)明显增加，提示PCNA与肌肉微损伤的自身修复有关。

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